1、1毛花柱忍冬 HPLC 指纹图谱的研究王孝勋 1 张守平 2 辛华 1 （1广西中医学院药学院，广西 南宁 5300012山东东阿胶股份有限公司，山东 聊城 252201）摘要 目的：探讨指纹图谱的建立方法和应用。方法：以毛花柱忍冬为例，RP-HPLC 法，采用 C18ODS2 柱（5m，4.6250mm） ，甲醇-乙腈- 0.05%磷酸梯度洗脱，流速 0.5ml/min，检测波长 328nm，柱温 25。结果：对 12 个毛花柱忍冬的样品图谱进行数据处理，建立毛花柱忍冬的指纹图谱。结论：毛花柱忍冬的指纹图谱可应用于鉴别和定量或半定量质量控制的标准。关键词 HPLC；指纹图谱；毛花柱忍冬Qua
2、ntitative Fingerprint Chromatogram of Lonicera Dasystyla Wang Xiaoxun, Zhang Shouping Xin hua*(1. Faculty of Pharmacy, Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning , Guangxi 5300012 Donge Ejiao Company Limited, Shandong Liaocheng 252201)Abstract Objective: To establish the fingerprint chr
3、omatogram of Lonicera dasystyla, and to probe and research the establishment method and application to the quantitative fingerprint chromatogram. Methods: RP-HPLC was used. The samples were separated on a C18 ODS2 column (5m, 4.6250mm) and detected at 328nm with methanol, acetonitrile and 0.05% phos
4、phoric acid as mobile phase by gradient elution. The column temperature was set at 25. The flow rate was 0.5ml/min. Results: The fingerprint chromatogram based on the data of 12 batches of Lonicera dasystyla was set up. Conclusion: The fingerprint chromatogram of Lonicera dasystyla can be used to re
5、cognize and access other samples as a standard.Key words HPLC; fingerprint chromatogram; Lonicera dasystyla Rehd毛花柱忍冬 Lonicera dasystyla Rehd.原为大宗常用药材金银花的一个来源品种，主产广西 1。中国药典(2000 年版)记载：金银花为忍冬科植物忍冬基金项目：忻城金银花种源评价与资源可持续利用共性关键技术研究 广西科技厅（桂科攻 0815005-2-5） ；毛花柱忍冬的指仪图谱研究 广西中医学院高学历科研启动基金 G200308作者简介：王孝勋，男（汉）
6、，湖南常德人，讲师，硕士，研究方向：中草药品种、质量及资源开发研究,Tel: 0771-3137535 Email:.*通讯作者：辛华，讲师，硕士，研究方向：药物质量分析.Tel：0771-3111585 Email:2Lonicera japonica thunb.、红腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、山银花Lonicera confusa DC.或毛花柱忍冬 Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花。具有清热解毒、凉散风热的功效，用于痈肿疔疮，喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热。金银花主要含挥发油、黄酮类、有机酸和三萜类等化学成分
7、；有抗病原微生物、抗炎、解热、保肝等药理作用 2。因其对多种致病菌均有很好的抑制作用，不少中成药均以其作为原料药。对于金银花药材，国内指纹图谱研究最多的品种是忍冬 Lonicera japonica thunb.,但是主产广西的品种毛花柱忍冬 Lonicera dasystyla Rehd.的未见有报道。为弄清毛花柱忍冬真正的质量品质，本研究采用自行研发的“中药指纹图谱标准数据库建立及样品识别系统”对实验数据进行处理，采用高效液相色谱法（HPLC）,建立毛花柱忍冬的指纹图谱分析方法，建立能比较完整地反映其内在质量的质量控制方法，为指导金银花或山银花的规范化种植及正确采收提供依据。1 仪器与试药
8、1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）：紫外检测器，Agilent 化学工作站；Hypersil C18ODS2 色谱柱（5m，4.6250mm，大连依利特公司） ；德国赛多利斯公司 BP211D 电子分析天平；Millipore simplicity-185 超纯水器（美国密理博公司） ；SB3200T 超声波清洗器（上海必能信有限公司） ；水系 0.45m 微孔滤膜（德国 MEMBRANA 公司） ；微量取液器（北京表云仪表有限公司） 。1.2 试药 毛花柱忍冬药材采自广西南宁、崇左、河池等地，经广西中医药研究院方鼎研究员鉴定为毛花柱忍冬 Lonicera
9、 dasystyla Rehd.，见表 1。绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈（色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司） ，超纯水，其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 供试品的制备 精密称取 1.0000g 毛花柱忍冬（过 40 目筛） ，置 250 ml 的锥形瓶中，精密加 40%的乙醇溶液 50ml，称定重量，浸润 10 分钟，超声75 分钟，放冷，抹干瓶壁，称重并补足重量，滤纸过滤，微孔滤膜滤过于高效液相进样瓶中，即为药材浓度为 0.02g/ml 的供试品溶液。2.2 色谱条件 Hypersil C18ODS2 色谱柱（5m ，4.6250mm，大连依利特公司） ，流
10、动相 0 分钟 乙腈-甲醇-0.05%磷酸(6：4：90)，60 分钟乙腈-甲醇-0.05%磷酸(18：12：70)，60-80 分钟 乙腈-甲醇-0.05%磷酸(18：12：70)，流速 0.5ml/min，检测波长 328nm，柱温 25。进样 10l 两次。2.3 数据处理及结果2.3.1 数据来源 本文数据表中保留时间、峰面积、峰高、峰宽的原始数据由高效液相导出，分离度、相对保留时间由计算机程序计算添加。2.3.2 本文选取两个标志性强的 s1,s2,作为参照峰，相对保留时间 rt 由3公式（1）得 )1.(2)1()2( sntsstntstr式（1）中 s1、s2（s1s2）为参照
11、峰的保留时间，s1、s2为调整保留时间，其它色谱峰的保留时间为 tn，调整保留时间为 tn，相对保留时间为 rt，为高效液相仪死时间，由公式（1）知，相对保留时间与死时间无关，故可以消除不同仪器的死体积不同而引起的误差。2.3.3 标准指纹图谱建立 抽取每个样品共有峰表的各个物质峰数据，包括保留时间、峰面积、峰高、峰宽、分离度、相对保留时间，并计算各指标的均数、标准偏差和相对标准偏差，汇成物质峰表，如表 2 为绿原酸物质峰表。抽取每个物质峰表中的各指标的均数、标准偏差和相对标准偏差，汇成广西毛花柱忍冬指纹特征标准表，见表 3，模拟图谱见图 1。图1毛花柱忍冬指纹特征标准图谱模拟图表 1 样品信
12、息编号 产地 加工 编号 产地 加工1 南宁市双定镇古典村 晾、阴 7 横县云表职中旁 晾、晒1 南宁市双定镇古典村 晾、阴 7 横县云表职中旁 晾、晒2 扶绥县山圩镇政府旁 晾、晒 8 龙州金龙乡双蒙村 晾、晒2 扶绥县山圩镇政府旁 晾、晒 8 龙州金龙乡双蒙村 晾、晒3 南宁市伶俐镇石塘村 晾、晒 9 宁明县亭亮镇火车站旁 晾、晒3 南宁市伶俐镇石塘村 晾、晒 9 宁明县亭亮镇火车站旁 晾、晒4 南宁市双定镇古典村 晾、晒 10 马山县古寨乡古寨 晾、晒4 南宁市双定镇古典村 晾、晒 10 马山县古寨乡古寨 晾、晒5 南宁市双定镇古典村 晾、晒 11 都安县澄江乡六里村 晾、晒45 南宁市
13、双定镇古典村 晾、晒 11 都安县澄江乡六里村 晾、晒6 横县南乡镇大塘村 晾、晒 12 马山县古寨乡 熏硫6 横县南乡镇大塘村 晾、晒 12 马山县古寨乡 熏硫表 2 绿原酸物质峰共有峰表名 保留时间 峰面积 峰高 峰宽 分离度相对保留时间mhz060302 28.0335 3066.14 165.0323 0.2881 17.93926 0mhz060306 28.02016 3079.035 167.0833 0.28634 18.02486 0mhz060309 27.96186 21283.21 1149.454 0.28736 7.07793 0mhz060310 27.98164
14、 21301.63 1139.719 0.2894 6.97932 0mhz060311 28.01773 9588.28 512.3346 0.28968 2.5251 0mhz060312 28.0233 9586.39 522.6273 0.28534 2.5339 0mhz060313 28.02902 6494.553 350.5422 0.28749 1.87136 0mhz060314 28.00393 6495.652 354.5342 0.2851 1.87074 0mhz060315 27.88213 7548.316 415.7115 0.28318 1.84794 0m
15、hz060316 27.90826 7540.354 415.9729 0.28137 1.82688 0mhz060317 28.04945 12366.27 666.1108 0.28939 1.72856 0mhz060322 28.16089 12455.53 670.5577 0.28951 1.71694 0mhz060319 28.24792 5740 304.9482 0.2924 12.99523 0mhz060325 28.17312 5778.485 308.8365 0.29109 13.08361 0mhz060321 28.22232 5517.706 297.65
16、81 0.28761 13.20565 0mhz060326 28.17977 5535.759 296.3124 0.29076 13.15529 0mhz060328 28.18574 7040 377.0591 0.29063 13.06547 0mhz060330 28.39676 7197.193 383.621 0.29168 13.08926 0mhz060329 28.4055 15775.42 833.3567 0.29511 12.37172 0mhz060331 28.45327 15832.78 843.825 0.2917 12.60163 0mhz060332 28
17、.48428 5234.422 280.0535 0.29232 13.67607 0mhz060334 28.51299 5250.546 282.1251 0.28992 12.9966 0mhz060336 28.45873 40692.27 2120.602 0.30104 9.31891 0mhz060337 28.47241 40818.22 2115.977 0.30222 9.31058 0均值 28.1777 11717.42 623.9189 0.28995 8.95053 0标准差 0.20474 10269.95 533.615 0.00476 0.1124 0相对标准
18、差 0.00727 0.87647 0.85526 0.00068 0.01256 05表 3 广西毛花柱忍冬指纹特征标准保留时间 峰面积 峰高 峰宽 分离度相对保留时间均值 19.59972 683.513 37.74674 0.28429 39.9513-0.23154标准差 0.20625 324.1743 17.82798 0.006 0.09613 0.00109相对标准差 0.01052 0.47428 0.4723 0.00086 0.00241 -0.0047均值 28.1777 11717.42 623.9189 0.28995 8.95053 0标准差 0.20474 10
19、269.95 533.615 0.00476 0.1124 0相对标准差 0.00727 0.87647 0.85526 0.00068 0.01256 0均值 31.59067 390.2101 21.09224 0.28755 6.46257 0.09212标准差 0.26754 180.947 9.76081 0.00259 0.10806 0.00183相对标准差 0.00847 0.46372 0.46277 0.00037 0.01672 0.01982均值 35.15493 729.0126 33.0911 0.33559 6.73621 0.18834标准差 0.28207 7
20、43.4572 33.43799 0.0083 0.10442 0.00224相对标准差 0.00802 1.01981 1.01048 0.00119 0.0155 0.01192均值 56.70884 274.1548 13.63578 0.32533 19.1347 0.77014标准差 0.30817 75.38919 4.59985 0.09794 0.10325 0.00909相对标准差 0.00543 0.27499 0.33734 0.01399 0.0054 0.0118均值 64.33016 409.9917 18.99938 0.32963 8.96405 0.97586
21、标准差 0.24447 180.3235 9.03364 0.01532 0.09865 0.00156相对标准差 0.0038 0.43982 0.47547 0.00219 0.011 0.0016均值 65.225 11559.39 557.5933 0.3207 1.62143 1.00001标准差 0.22188 7257.22 350.776 0.00186 0.10353 0.00006相对标准差 0.0034 0.62782 0.62909 0.00027 0.06385 0.00006均值 72.88522 2758.889 106.181 0.40285 8.091 1.2
22、0678标准差 0.21299 1286.994 49.51546 0.00428 0.09949 0.00112相对标准差 0.00292 0.46649 0.46633 0.00061 0.0123 0.000933 讨论 3.1 目前多采用单参照峰法计算相对保留时间，无法消除死时间，而本文采用的双参照峰的相对保留时间计算法可以消除死时间的影响。3.2 本文中的毛花柱忍冬与同属其他种忍冬的图谱具有较大的相似性，这也说明了它们之间的亲缘关系。为达到种间的鉴别，还需对大量样品进行统计，从种之间所含化学物质的多少上找到种之间的指纹鉴别特征。63.3 广西毛花柱忍冬指纹特征标准表由每个物质峰表中的
23、各指标的均数、标准偏差和相对标准偏差汇成。其中标准偏差和相对标准偏差反映了样品间各指标的稳定性、重现性。3.4 广西毛花柱忍冬指纹特征标准表作为对比标准，对明确成分，如本文中的绿原酸，可通过建立标准曲线，直接计算含量进行对比，对不明确成分，如其他物质，可以用峰面积半定量地对比，达到多指标控制质量的目的，从而指导毛花柱忍冬的规范化种植及正确采收和加工。3.5 本文没有采用药典委员会推荐的中药指纹图谱相似度计算软件，主要为了便于图谱数据导入与导出，及增加其他如含量测定数据批量处理、保留时间矫正等的功能，本方法更注重单个成分之间与纵向比较，而不是模糊的横向相似度的比较，特别适用于样本时间跨度长、空间范围小的明确成分定量、不明确成分半定量的内部质量控制。为中药指纹图谱在不同领域应用及数据重复应用提供的思路及实例。参考文献:1.李家实.中药鉴定学.上海:上海科学出版社，1996:355-358 2.于生兰,张龙,孙玲.金银花的研究进展.时珍国医国药，2002，13（8）:498-500
