1、蒺藜提取物对 ADR 所致大鼠心肌细胞凋亡的影响张晓丹 *，吕高照，蔡瑞雪(哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076)摘要 目的：研究蒺藜提取物对阿霉素(ADR)所致大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法：将蒺藜提取物灌胃于 ADR 所致心肌细胞凋亡的大鼠,采用电镜对大鼠心肌细胞进行超微结构观察，采用 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡指数，免疫组化 SP 法检测心肌细胞 Bax、Bcl-2 蛋白的表达。结果：ADR 累积用量 20 mgkg-1可致大鼠心肌细胞凋亡，蒺藜提取物中、高剂量组(40 mgkg-1、60 mgkg-1)可减轻心肌细胞超微结构的损伤，蒺藜提取物中、高剂量组较模型组均可显著
2、降低细胞凋亡率(P0.05)。蒺藜提取物中、高剂量组可显著上调 Bcl-2 表达(P0.01)、下调 Bax 表达(P0.05)。结论：蒺藜提取物可抑制 ADR 所致大鼠心肌细胞的凋亡，对阿霉素所致的心脏毒性有保护作用。关键词 蒺藜提取物；阿霉素；心肌细胞；凋亡Effect of extract fromTribulus terrestris L on cardiocyte apoptosis caused by adriamycin in ratsZHANG Xiao-dan *, LV Gao-zhao, CAI Rui-xue( School of Pharmacy, Harbin Un
3、iversity of Commerce, Harbin 150076, China)Abstract Objective:To study the effect of extract fromTribulus terrestris L on cardiocyte apoptosis caused by adriamycin in rats.Methods: Rats were given intraperitoneal injection of adriamycin(ADR) to induce cardiocyte apoptosis. After continuous ig of ext
4、ract fromTribulus terrestrisL, the every experimental group was observed myocardial ultrastructure with electron microscope,. The apoptotic rate of myocardial cells was determined by terminal deoxynucleotidyl transferaseediated dUTP nick-end labeling (TUNEL), and the expression of bcl-2 and bax was
5、detected by using immuno-histochemical method.Results: ADR of 20 mgkg-1was given to rats intermittently induced1 cardiocyte apoptosis. Extract from Tribulus terrestrisL middle-and high-dosage groups (40 mgkg-1, 60 mgkg-1) could reduce cardiotoxicity injury of ADR . Extract from Tribulus terrestrisL
6、middle-and high-dosage groups could significantly increased the bcl-2 expression (P 0.01), reduced bax expression (P 0.05), Conclusion:Extract fromTribulus terrestrisL may decreased the induced cardiocyte apoptosis by adriamycin, and has a protective effecton adriamycin-induced car-diotoxicity.作者简介：
7、张晓丹(1958-)，女，博士，教授，硕士研究生导师，主要研究方向：心血管药理;Tel：0451-84605022 ，E-mail：Key words: Tribulus terrestrisL extract; adriamycin；myocardial cells ; apoptosis阿霉素(adriamycin，ADR)属于蒽醌类抗生素，是一种高效广谱的抗肿瘤药物，临床上常用于治疗多种肿瘤，但由于其对心肌有毒性损伤作用，严重时可致阿霉素性心肌病 1 ，使其临床应用受到一定的限制，故研究和寻找减轻ADR对心肌毒性损伤的药物具有重要的意义。近年来的研究证实ADR 导致心肌细胞凋亡在其对心肌
8、的毒性损伤机制中起重要的作用。蒺藜提取物中主要的活性成分是蒺藜皂苷，其药理活性强，药效明确，毒副作用少，相关研究表明， 蒺藜提取物具有降血压、舒张血管、降低胆固醇和抗动脉粥样硬化、改善血液流变性等作用，其对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤、急性脑缺血损伤 2-5等均具有保护作用，对大鼠脑缺血后神经细胞凋亡也有抑制作用。而在蒺藜提取物对阿霉素引起的大鼠心肌细胞凋亡抑制作用机制的研究，还很少报道。本课题旨在通过研究蒺藜提取物对阿霉素引起的心肌细胞凋亡的影响，从而为蒺藜提取物临床防治阿霉素心脏毒性提供药理学依据。1 材料 1. 1 动物 健康W istar 大鼠50只，雌雄各半，体重18020 g( 哈尔
9、滨医科大学实验动物中心提供)。实验期间，饲养条件：室温2026 ，相对湿度40% 70% ，人工昼夜(12 h白昼,，12 h黑夜)，自由饮水，常规适应性饲养 1周后进行实验。1. 2 药品与试剂 蒺藜提取物购于西安天一生物技术有限公司，纯度为90%，批号TYT080228，注射用盐酸阿霉素购于深圳万乐药业有限公司，批号H090621；原位细胞凋亡检测试剂盒，购于华莱生物公司；抗Bax抗体(兔IgG 多抗)；抗Bcl-2抗体(兔IgG 多抗)，购于武汉博士德公司。1. 3 仪器 JEM-100CX透射电镜(日本电子公司)；石蜡切片机(SM-2000R型)（武汉海瑞特科技有限公司） 、BTR-M
10、187123 摄影显微镜（北京中西泰安技术有限公司） ；Image ProPlus 4.5图像分析系统（上海申腾信息技术有限公司） 。2 方法2. 1 动物分组与给药 健康W istar大鼠50只,雌雄各半，随机分成5组，每组10只。ADR+蒺藜提取物各组中蒺藜提取物的低、中、高剂量分别为20，40，60 mgkg -1 。(1)ADR 组：于实验开始后第2、4天腹腔注射ADR mgkg -1，第6、8天腹腔注射ADR 2 mgkg -1，第10、12天腹腔注射ADR 3 mgkg -1，第14、16天腹腔注射ADR 4 mgkg -1，16 d累计用药剂量达20 mgkg-1 12, 13；
11、(2)ADR+蒺藜提取物 组：蒺藜提取物每日灌胃给药20 mgkg -1；(3)ADR+蒺藜提取物组：蒺藜提取物每日灌胃给药40 mgkg -1；(4)ADR+蒺藜提取物组：蒺藜提取物每日灌胃给药60 mgkg -1。各组蒺藜提取物于实验第一天起开始给药，每日灌胃 1次，连续16 d，同时，ADR给药剂量、给药时间、给药次数同ADR组。蒺藜提取物灌胃给药是在腹腔注射ADR前30 min进行； (5)正常组：实验处理同ADR组，腹腔注射等剂量生理盐水。2.2 心肌组织的电镜观察 大鼠心脏分离后，迅速取心尖部分约1 mm1 mm1 mm大小，2. 5%戊二醛固定1. 5 h，1%锇酸固定1 h，经
12、50%、70% 、80% 、90%、100%丙酮逐级脱水，以包埋剂环氧树脂821包埋聚合，超薄切片机切片，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。2.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡率 根据试剂盒的说明书进行操作，大致过程如下：用蛋白酶K消化以暴露DNA，在末端转移酶介导下，用连接碱性磷酸盐的dUTP对DNA 裂解部分进行标记，然后再用免疫组织化学方法显色，正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。阴性对照用双蒸水代替试剂盒中的反应混合物，不用苏木素复染，其余步骤不变。每组随机选取6只大鼠，每只大鼠观察5张切片，按说明书操作，400倍光镜下计算阳性细胞数和细胞总数，按公式：阳性细胞
13、/细胞总数100% ，取其比值的平均值为心肌细胞凋亡率。2.4 免疫组化检测Bax、Bcl-2蛋白表达 按照试剂盒说明书进行免疫组化操作。主要步骤: 组织切片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟，然后进行脱腊、水化；3%H 2O2室温孵育10 min，清除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水清洗；将切片放入 0.01 mol (pH 6.0)枸橼酸缓冲液中，置微波炉内修复抗原15 min；滴加适当比例稀释的一抗 (1100)，阴性对照用PBS代替一抗。冰箱中过夜，滴加生物素化IgG(二抗)工作液，37孵育30 min ，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温下孵育30 min，应用 DAB溶液
14、显色，镜下出现棕色反应，即用自来水终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。每组随机选取6只大鼠，每只大鼠观察5张切片，用Image ProPlus 4.5图像分析系统检测阳性染色光密度值，每张切片随机检测5个视野，计算平均光密度值。2.5 统计分析 实验数据以 s表示，采用SPSS16.0软件进行随机区组设计的单因素方差分析(ANO-VA)，x组间多重比较采用最小显著差法(LSD)，P0.05为差异有显著性。3. 结果3.1 蒺藜提取物对心肌细胞超微结构的影响 电镜下观察结果见图1：图1 电镜下蒺藜提取物对心肌细胞超微结构的影响10 000a 正常组 b ADR模型组 c ADR+蒺藜提取物组
15、d ADR+蒺藜提取物组 e ADR+蒺藜提取物组 (a)模型组：细胞有很大程度的形态改变，线粒体 弥漫性肿胀，嵴变短、断裂，甚至成空泡样，肌浆网扩张，肌丝紊乱；细胞膜内陷核染色质浓缩、凝集成团块状，还可见核碎裂，细胞器变化不明显。(b)正常组：心肌细胞超微结构正常。心肌纤维肌膜完整 ,肌原纤维排列整齐，明、暗带清楚，线粒体结构清楚，膜完整，嵴致密，排列规则，其上附着之基粒结构清晰，肌浆网、横小管清晰可见。(c)ADR+蒺藜提取物 组：线粒体肿胀有一定的减轻，线粒体嵴仍有所改变，有空泡形成，基质密度有一定的增强。(d)ADR+ 蒺藜提取物组：心肌纤维肿胀进一步减轻，仍有个别线粒体出现空泡、肿胀
16、，部分嵴模糊，排列尚规则。(e)ADR+蒺藜提取物组：心肌纤维结构基本恢复正常：线粒体结构较完整，嵴致密集，排列较整齐，线粒体肿胀明显减轻，接近阴性对照组。3.2 对细胞凋亡率的影响 结果显示，正常组大鼠偶见心肌细胞凋亡的阳性标记；模型组大鼠心肌细胞核内可见到较多棕黄色核染，与正常组比较有显著差异性(P0. 01)；所有给药组细胞凋亡均有不同程度的下降，其中中、高剂量组的下降程度更加明显，与模型组比较有统计学意义(P0. 01)，各组凋亡及其指数比较结果见表1。表1 各组心肌细胞凋亡指数( s,n=6)x组 别 n 凋亡细胞数（%） 正常组 6 0.710.32模型组 6 29.473.28*
17、ADR+蒺藜提取物组 6 21.322.34ADR+蒺藜提取物组 6 14.862.15ADR+蒺藜提取物组 6 12.631.97注：与正常组比较， *P0.05， *P0.01；与模型组比较, P0.05， P0.013.3 各组心肌细胞Bax与Bcl-2蛋白表达 Bax, Bcl-2蛋白阳性反应为黄色或棕黄色颗粒，定位于胞膜、胞浆。结果显示正常组有少量Bax蛋白表达；与正常组比较，模型组Bax蛋白表达显著增加(P0.01)；与模型组比较，蒺藜提取物中、高剂量组Bax蛋白表达显著减少(P0.05)。正常组有少量Bcl-2蛋白表达；与正常组比较，模型组Bcl-2蛋白表达显著增加(P0.05)
18、；与模型组比较，蒺藜提取物低剂量组Bcl-2蛋白表达明显增加(P0.05)，蒺藜提取物中、高剂量组Bcl-2蛋白表达显著增加(P0.05或P0.01)。从Bcl-2/Bax的比值也可以看出，模型组与正常组比较，Bcl-2、Bax表达均显著增加，但Bcl-2增加的幅度小于Bax，故模型组凋亡率上升，而各给用药组Bcl-2/Bax的比值明显上升，抑制了心肌细胞凋亡，细胞凋亡率下降(表2) 。结果提示蒺藜提取物可能通过下调Bax蛋白表达、上调 Bcl-2蛋白表达而起到抗凋亡作用。各组心肌细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达图像见图2和图3，Bax、Bcl-2蛋白表达的OD值比较结果见表2。图2 各组ba
19、x蛋白表达 (400) 正常组 ADR模型组ADR+蒺藜提取物组 ADR+蒺藜提取物组 ADR+蒺藜提取物组图3 各组bcl-2蛋白表达 (400) 正常组 ADR模型组ADR+蒺藜提取物组 ADR+蒺藜提取物组 ADR+蒺藜提取物组表2 各组bax、bcl-2蛋白表达的 OD值比较( s,n=6)x组 别 bax bcl-2 bcl-2/bax正常组 38.278.60 94.317.25 2.460.78模型组 417.1865.33* 208.4621.84* 0.500.13ADR+蒺藜提取物组 292.3527.68 334.6538.09 1.070.24ADR+蒺藜提取物组 23
20、0.3421.37 427.4772.20 1.860.49ADR+蒺藜提取物组 207.4022.51 448.2985.93 2.160.65注：与正常组比较， *P0.05， *P0.01；与模型组比较, P0.05， P0.014 讨论阿霉素是一种高效的广谱抗肿瘤药物，临床上常用于治疗多种肿瘤，但其具有严重的心脏毒性，对心肌有损伤，阿霉素所引起的心肌损伤机制尚未完全阐明，目前已经证实ADR进人心肌细胞后产生活性氧 (Reactive oxygen species，ROS)，并由这些ROS引起心肌损伤是ADR 对心肌毒性损伤的重要机制 6 ，近年来的研究证实ADR导致心肌细胞凋亡而损伤，
21、有报道 7认为阿霉素对心肌的损伤作用与其所引发的心肌细胞凋亡有密切关系，心肌细胞凋亡是阿霉素心肌病的重要机制。本实验研究显示，阿霉素组心肌细胞凋亡率明显高于空白对照组，进一步说明细胞凋亡参与了阿霉素对心肌的损伤作用。Bax是与Bcl-2结构相似的一种蛋白,但它的作用与Bcl-2完全相反,有促进细胞凋亡的作用。Hochhauser 等 8用转基因鼠实验证实 ,Bax基因高表达可促进心肌细胞凋亡 ,表达的程度与心肌凋亡的程度呈正相关。Bax通过与线粒体上Bcl-2蛋白形成二聚体发挥作用,当Bax高表达时,形成同源二聚体Bax/Bax促进心肌细胞亡；Bcl-2高表达时,形成异源二聚体Bcl/Bax抑
22、制凋亡发生 9。本实验结果显示：ADR造模后的大鼠心肌细胞凋亡率显著升高, ADR+蒺藜提取物各剂量组与ADR组相比较，凋亡指数明显下降，提示蒺藜提取物能抑制阿霉素所致的大鼠心肌细胞凋亡。ADR+ 蒺藜提取物各剂量组与ADR 组相比较， Bcl-2的蛋白表达升高，bax 的蛋白表达下降，结果提示蒺藜提取物可能通过下调Bax蛋白表达、上调Bcl-2蛋白表达，提高Bcl-2，Bax 比值，从而抑制阿霉素所致的心肌细胞凋亡。参考文献1 章敏, 吕宝经, 荣烨之. 福辛普利对阿霉素中毒心肌的保护作用 J. 上海第二医科大学学报, 2001,22(1):19-212 侯俊英, 王秀华, 李红, 等. 蒺
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