荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件beacon Designer 有时一对100分的引物扩增效率特别低换了一对貌似很烂的引物结果溶解曲线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关 看引物Tm值相差是否很高适当降低反应退火温度看看是否有效 看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。 看所用扩增基因是否为组织特异性表达 看RNA是否完整是否降解反转录过程是否完整 设好内参正对照 最后所有这些都满足还是没扩增出来重新设计引物吧 1设计的时候尽量靠近基因的3端这样能最大限度地保证扩增效率 2尽量跨越内含子这样可以保证检测有无基因组污染 3两条引物的Tm值不要相差太大 4产物长度保证在80200bp之间最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化最好设计的时候记录下产物的Tm值这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上一般Tm80以下的峰都是引物二聚体对于水稻等GC含量比较高的基因组产物Tm不要高于94个人观点。如果同时检测很多对基因的表达量变化我会尽量调整所有产物的Tm值与内参产物的Tm相差不
