1、1绿色荧光裸鼠血液生理生化指标检测分析尤金炜，张立波，方天，田小芸，刘彪，周森妹，梁磊，董敏，胡文娟，赵志刚， 恽时锋（南京 军区南京总医院比较医学科，全 军实验动物科普与伦理教育基地，全国科普教育基地，江苏南京，210002）摘要：目的 检测绿色荧光蛋白（Green Fluorescence Protein，简称 GFP）转基因裸鼠血液生理生化指标，为将来的研究提供基础参考值。 方法 ：实验选用 68 周 GFP 转基因裸鼠及对照组 BABL/C 裸鼠雌雄各 30 只，取血测定血生化和血常规指标。 结果：GFP 转基因裸鼠与对照组 BABL/C 裸鼠比较，白细胞总数(WBC)、尿素(URE)
2、、平均血红蛋浓度(MCHC)、葡萄糖(GLU)差异极显著(P 0.01)；血红蛋白(HGB)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板 计数(PLT) 、尿酸(UA)差异显著(P 0.05)，其它指标差异不显著。GFP 转基因裸鼠雌雄间比较，红细胞分布宽度(RDW)、平均血红蛋白含量(MCH) 、平均血红蛋浓度(MCHC)、血小板 计数(PLT)、球蛋白(G)、胆固醇 (TC)、HDL-胆固醇(HDL-TC) 差异极显著(P 0.01) ，白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)差异显著( P 0.05)，其它指 标差异不显著。 结论：转基因 GFP 转基因裸鼠的生理生化指标值在雄雌间有一定的差异，为相关的
3、生物医学研究提供了基础数据。关键词：GFP 转 基因裸鼠；血常规 ；血生化引言转基因动物是指将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体表达外源基因的动物 1 。来源于水母(Aequorea Victoria) 的绿色荧光蛋白( Green fluorescent protein, GFP),现已成为细胞生物学和分子生物学中应用最广泛的分子标记之一，在制作转基因动物过程中更是如此 2 。GFP 转基因裸鼠是本科室工作人员通过多年的杂交回交选育而成 3 ，选育方法：选择自带GFP 转基因的C57BL/6 小鼠与BALB/c裸鼠杂交，并与BALB/c裸鼠回交并经逐代选育，选育至第六
4、代，产生了GFP基因表达较为稳定的BALB/c绿色荧光裸鼠。C57BL/6中插入的GFP绿色荧光蛋白基因序列号为：GenBank L29345.1，同时转入鸡-actin启动子序列，转入巨细胞病毒的增强子，增强GFP 基因表达。增强的绿色荧光蛋白常常是作为示踪标记，大部分脏器都表达绿色荧光，包括心脏，肺脏，脾脏，胰腺，食管，胃，十二指肠，皮肤、血细胞和肌肉等，可见细胞与间质都呈绿色，基金项目 南京军区南京总医院院管课题(2012052)作者简介 尤金炜（1983-） ，男，本科，南京军区南京总医院比较医学科技师。2通讯作者 恽时锋（1965-） ，男，主任技师，教授，博士，研究生导师，从事医学
5、实验动物学工作。但颜色深浅的程度不同 4 。GFP转基因裸鼠在心血管研究、遗传研究及生殖生物学研究中应用普遍。由于血液学指标是许多实验中重要的参考值,因此对该鼠的血常规、血生化进行了测定，为该转基因鼠的健康评价、疾病诊断、实验动物模型的建立及生理、药理、毒理实 验研究提供参考，同时也为外源基因的整合对宿主的影响积累资料。1 材料和方法1.1 实验动物GFP 转基因裸鼠及 BALB/c 裸鼠均由本科选育，选取 6 8 周龄雄雌小鼠各 30 只进行实验，动物使用许可证号为 SYXK（军）2012-0047 ；动物生产许可证号为 SCXK（军）2012-0014。1.2 饲养管理及环境实验小鼠均饲养
6、在屏障环境中，室内的温湿度均由中央空调控制，温度为 2026，相对湿度为 50%-70%，光照明暗交替 12h /天。小鼠所食饲料为江苏协同医药生物工程有限责任公司提供 60Co 辐射饲料，营养成份为：水分 9.4%，粗蛋白 21.90%，粗脂肪为 6.73%，粗灰份为 6.3%，粗纤维 2.54%，钙 1.34%，磷 0.96%，饲料生产企业审查合格证号为：苏饲审 (2008)01008，另每周加喂一次葵花籽。饮水为消毒的酸化水，使用的垫料、笼盒等一切用具均进行 131 5min 高压预真空灭菌。1.3 仪器与试剂日立 7600 全自动生化分析仪（日本） ，Sysmex Xs-800i 血常
7、规自动检测仪（日本） 。1.4 方法摘眼球采血后，EDTA-K2 抗凝，Sysmex Xs-800i 血常规自动检测仪检测。测定指标包括：白细胞总数(WBC)，红细胞计数(RBC) ，血红蛋白(HGB) ，红细胞压级(HCT) ，平均红细胞体积(MCV)，红细胞分布宽度(RDW)，平均血红蛋白含量 (MCH)，平均血红蛋浓度(MCHC)，血小板计数(PLT) 。余下的全血以 4000r/min 的速度离心 10min，分离血清后日立7600 全自动生化分析仪检测。测定指标包括：总蛋白(TP) ，白蛋白(ALB) ，球蛋白(G) ，谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶 (AST)，尿素(URE)，肌
8、酐(CRE) ，尿酸(UA)，葡萄糖(GLU)，胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)， HDL-胆固醇(HDL-TC)。1.5 统计学分析使用 SPSS13.0 统计软件，采用 t 检验对数据进行显著性检验，统计结果以 表示。sX2 结果32.1 GFP 转基因裸鼠与 BALB/c 裸鼠间比较从表 1-2 可知，GFP 转基因裸鼠与对照组 BALB/c 裸鼠间比较，WBC、URE、MCHC、GLU 差异极显著( P 0.01)； HGB、RDW、PLT、UA 差异显著(P 0.05)，其它指标差异不显著。2.2 GFP 转基因裸鼠雄雌生理生化间比较从表 3-4 可知，BALB/c 裸鼠雌雄间比较，
9、TC、TG 、HDL-TC 差异极显著(P 0.01)，WBC、AST、GLU 差异显著( P 0.05)，其它指标差异不显著。GFP 转基因裸鼠雌雄间比较，RDW、 MCH、MCHC、PLT 、G 、TC、HDL-TC 差异极显著(P 0.01)，ALB、GLU 差异显著(P 0.05)，其它指标差异不显著。3 讨论实验动物作为现代科学技术中“活的试剂”、 “活的精密仪器 ”，血液学生理生化常数是鉴定其遗传品质的重要依据 5 。本实验选择 BALB/c 裸鼠作为对照组，虽然 GFP 转基因裸鼠是在 BALB/c 裸鼠的基础上构建成功的，但在生理、生化等指标上确实存在差异，9 项生理指标有 5
10、 项差异显著，其中 WBC、MCHC 差异极显著，而 WBC 也通常被称为免疫细胞，是监测机体的免疫防御功能，现已成为免疫力低下动物模型的重要参考指标之一，检测结果显示两者虽然差异极显著，但是两者远低于小鼠的正常值 1 ， 这与本实验室方天 6 等报道的结果相一致。12 项生化指标中 UA 差异显著，URE、 GLU 差异极显著，整体差异性不大。本实验选择的 GFP 转基因裸鼠与贺晓玉 7 等报道的 GFP 转基因小鼠在生理生化在数值上有一定的差异性，但是在与同样条件的对照组的差异性结果基本是一致的。GFP 转基因裸鼠在免疫指标 WBC、肾功能指标 URE 和 UA 以及血糖指标 GLU 上与
11、对照组的差异性十分明显，但是影响此结果的因素是否为外源基因 GFP 的导入及其发生机制尚需进一步研究。本次检测结果发现，GFP 转基因裸鼠的血液生理生化指标在雌雄性别间均存在差异，对照组 BALB/c 裸鼠雌雄性别间也存在差异。这种雌雄间的差异性与田小芸 8 等报道的转基因小鼠及王冬平 9 等报道的近交系与远交群小鼠所得出的结果是一致的。但是 GFP 转基因裸鼠在雌雄间差异较对照组更为明显，统计结果显示，除了 GLU、TC、HDL-TC 等血糖和血脂指标，GFP 转基因裸鼠与对照组在雌雄间共同存在差异，GFP 转基因裸鼠在ALB、G、RDW、MCH、MCHC、PLT 等指标在雌雄间也存在差异。
12、可见品种、性别因素对部分的血液学指标是有影响的，因此在实际应用中要考虑雌雄间的差异。有关实验动物的血液生化指标在国内已有很多研究报道，本实验选择的 GFP 转基因裸4鼠与贺晓玉 7 等报道的 GFP 转基因小鼠、练有文 10 等报道的 BALB/cA 裸鼠及田小芸8 等报道的转基因 EGFP 小鼠相比较，各数值有一定的差异，可能是实验动物的生理生化指标的测定值易受实验动物的品种、性别、微生物等级、饲养环境、检测方法等诸多因素的影响，但是这些条件很难完全统一，因此建立各实验室自己的实验动物生理生化指标数据背景资料就显得非常的重要 11 。GFP 转基因裸鼠因自身含有标记蛋白与其他实验小鼠相比而具
13、有明显的优势，本实验对 GFP 转基因裸鼠的血常规、血生化等方面的检测，积累了本品系鼠丰富的原始数据，为GFP 转基因裸鼠的深入研究及应用推广建立了较为系统的原始资料。参考文献1 施新猷，王四旺，顾为望，等. 比较医学 M. 陕西西安：陕西科学技术出版社，2003.104-105.2 Yang M, Baranov E, Moossa AR, et al. Visualizing gene expression by whole-body fluorescence imaging J. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97 :12278-12282.3 张立波，刘彪
14、，田小芸等 . 绿色荧光裸小鼠的选育初报J. 实验动物与比较医学， 2013，33：306-309. 4 Yang M, Reynoso J, Jing P, et al. Transgenic nude mice with ubiquitous green fluorescence protein expression as a host for human tumorsJ. Cancer Res, 2004, 64 :8651-8656.5恽时锋，朱虹，等.在生命科学中影响动物实验结果的多因素分析 J. 医学研究生学报，2003，16：372-375,378.6 方天，尤金炜，张立波等.
15、GFP 转基因裸鼠脾脏组织学观察J. 中国比较医学杂志，2012，22：6-97 贺晓玉，何君，徐艳峰，等. 绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理生化常数 J. 中国实验动物学报，2011,19: 146-149.8 田小芸，恽时锋，胡玉红，等.转基因 EGFP 小鼠血液生理生化指标的测定 J.实验动物科学，2008，25：56-58.9 王冬平，李善如，张敏，等 .三种小鼠血液生理生化正常值的测定 J.实验动物科学与管理，2000，17：24-28.10 练有文，王晖，倪少凯，等. 不同饲养密度对 SPF 级 BALB/cA 裸鼠血生化指标的影响J. 广东医学院学报，2010,28: 120-122
16、.11 闫寒，贺晓玉，秦超，等.绿色荧光裸鼠的建立和验证J. 中国比较医学杂志，2012，22：62-64.5Measurement of The Blood Biochemical Parameters inGFP Transgenic Nude MiceYOU Jin-Wei，ZHANG Li-Bo，FANG Tian，TIAN Xiao-Yun，LIU Biao，ZHOU Sen-Mei，LIANG Lei，DONG Min，HU Wen-Juan ，ZHAO Zhi-Gang，YUN Shi-Feng（Department of Comparative Medicine, Nanjin
17、g General Hospital of Nanjing Military Command, Army Education Base of Science and Ethics of Experimental Animal, National Science Education Base,Nanjing, 210002, China）Abstract: Objective To measurement normal range of the blood routine values and blood biochemical parameters of the GFP Transgenic
18、Nude Mice. To provide a basis for future research. Methods 68 weeks male and female 30 mice in each, were used in this experiment. Blood samples were measured using an automatic biochemical analyzer. Compared the differences between GFP Transgenic Nude Mice with BALB/c Nude Mic eand sexes. Results T
19、he comparison between GFP Transgenic Nude Mice and BALB/c Nude Mice revealed the values of WBC、URE、MCHC、GLU showed very significant difference( P0.01); HGB、RDW、PLT、UA difference ( P0.05).Making a comparison of the male and female of GFP Transgenic Nude Mice, the values of RDW、MCH、MCHC、PLT、G、TC、HDL-T
20、C showed very significant difference( P0.01); ALB、GLU showed difference ( P0.05). Conclusion There were some differences to some blood indicators between the male and female GFP Transgenic Nude Mice, the above data could be useful in the biomedical researches. Keywords GFP Transgenic Nude Mice; Bloo
21、d routine; Blood biochemical parameters表 1 GFP 转基因裸鼠和 BABL/C 裸鼠雄雌血常规间比较Tab.1 Blood routine examination of the GFP Transgenic Nude Mice and BABL/C Nude Mice组别Group只数Number白细胞总数WBC(109/L)红细胞计数RBC(1012/L)血红蛋白HGB(g/L)红细胞压级 HCT平均红细胞体积MCV(fl)红细胞分布宽度 RDW(%)平均血红蛋白含量 MCH(pg)平均血红蛋浓度 MCHC(g/L)血小板计数PLT(109/L)GF
22、P 603.58832.1330*11.58970.5781169.91678.3955*0.50890.024943.99831.888625.70171.8188*14.67830.5450333.40006.9896*1008.0667224.0279*B/C 604.86332.264011.21631.0317161.066713.71620.49830.036944.49672.001127.91333.558514.34000.3988322.433312.2522920.4333263.6635注：* P0.05 * P0.01 表示 GFP 与 B/C 之间6比较Note:
23、* P0.05 * P0.01 GFP vs B/C表 2 GFP 转基因裸鼠和 BABL/C 裸鼠雄雌血生化间比较Tab.4 The values of blood biochemistry of the GFP Transgenic Nude Mice and BABL/C Nude Mice组别Group只数Number总蛋白TP(g/L)白蛋白ALB(g/L)球蛋白G(g/L)谷丙转氨酶ALT(U/L)谷草转氨酶AST(U/L)尿素 URE(mmol/L)肌酐 CRE(mol/L)尿酸 UA(mol/L)葡萄糖GLU(mmol/L)胆固醇 TC(mmol/L)甘油三酯 TG(mmol/
24、L)HDL-胆固醇HDL-TC(mmol/L)GFP 6064.59676.017133.65333.229330.94335.167087.500031.0114177.366754.86447.49332.3836*29.83339.8439154.233344.5674*2.66671.0918*2.86370.64761.44570.55951.92800.3921B/C 6062.15004.344133.60333.116728.54674.497594.033333.7787 179.666749.5165 9.51333.0389 28.520010.2743 182.9667
25、57.2192 4.14671.5007 2.68930.6001 1.19330.4618 1.83800.3705 注：* P 0.05 * P0.01 表示 GFP 与 B/C 之间比较Note: * P0.05 * P0.01 GFP vs B/C表 3 GFP 转基因裸鼠和 BABL/C 裸鼠雄雌血常规间比较Tab.3 Comparison of blood routine examination between male and femal 组别Group只数Number白细胞总数WBC(109/L)红细胞计数RBC(1012/L)血红蛋白HGB(g/L)红细胞压级 HCT平均红细
26、胞体积 MCV(fl)红细胞分布宽度 RDW(%)平均血红蛋白含量 MCH(pg)平均血红蛋浓度 MCHC(g/L)血小板计数PLT(109/L)GFP 30 3.43671.887411.65400.6349168.53338.39020.50790.022543.74332.047726.32671.6398*14.48330.5528*330.80007.3457*1125.5333220.1742*GFP 30 3.74002.376211.52530.5179171.30008.30930.51000.027344.25331.711625.07671.798014.87330.46
27、90336.00005.6079890.6000158.3746B/C 30 3.84002.4130*11.11471.3212159.466717.00360.49650.045544.76002.065627.84003.516714.29330.3674319.733315.0545949.2667264.3049B/C 30 5.88671.597311.31800.6611162.66679.75170.50010.027144.23331.969727.98673.721714.38670.4357325.13338.2883891.6000269.0055注：* P 0.05
28、* P0.01 表示雄性与雌性之间比较Note: * P0.05 * P0.01 vs表 4 GFP 转基因裸鼠和 BABL/C 裸鼠雄雌血生化间比较Tab.4 Comparison of the values of blood biochemistry between male and femal组别Group只数Number总蛋白TP(g/L)白蛋白ALB(g/L)球蛋白G(g/L)谷丙转氨酶ALT(U/L)谷草转氨酶AST(U/L)尿素 URE(mmol/L)肌酐 CRE(mol/L)尿酸 UA(mol/L)葡萄糖GLU(mmol/L)胆固醇 TC(mmol/L)甘油三酯 TG(mmol
29、/L)HDL-胆固醇HDL-TC(mmol/L)GFP 30 66.32005.871632.38673.0622*33.93334.6610*92.466737.0190171.466733.30148.08673.072430.40007.3756168.933341.12083.08670.8331*3.35730.3918*1.54470.60452.24070.2186*GFP 30 62.87335.844534.92002.964127.95333.797382.533323.8503183.266771.07496.90001.254729.266712.0681139.533
30、344.27652.24671.1892.37000.43931.34670.51181.61530.24475B/C 30 62.53335.381932.77332.597129.76004.795298.600044.6347158.733336.1869*8.74673.662726.84008.8325174.80033.21833.54001.3463*3.0920 0.5679*1.48330.4649*2.13270.2507*B/C 30 61.76673.132234.43333.449827.33333.968789.4667 18.0708200.600053.201510.28002.110630.200011.6017191.13374.40134.75331.43672.28670.27570.90330.21311.54330.18827注：* P 0.05 * P0.01 表示雄性与雌性之间比较Note: * P0.05 * P0.01 vs
