1、本科毕业论文（20 届）绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究所在学院 专业班级 食品质量与安全 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - I -目录摘要 .IAbstract .II前言 .11 材料与方法 .21.1 材料与试剂 .21.2 仪器与设备 .22 试验方法 .32.1 绿原酸纳米硒的制备 .32.2 绿原酸纳米硒的表征 .32.2.1 紫外分光光度法 .32.2.2 傅里叶红外光谱分析法 .32.2.3 荧光光谱法 .32.3 绿原酸纳米硒抗氧化能力测定 .42.3.1 还原力的测定 .42.3.2 清除羟自由基能力的测定 .42.3.3 清除超氧阴离子自由基能力的
2、测定 .42.3.4 清除 ABTS+自由基能力的测定 .53 结果与分析 .53.1 绿原酸纳米硒稳定性分析 .53.2 绿原酸纳米硒的表征 .53.2.1 CGASeNPs 的紫外光谱分析 .53.2.2 红外光谱下的 CGASeNPs.63.2.3 绿原酸纳米硒荧光光谱分析 .7- II -3.3 绿原酸纳米硒抗氧化能力的测定 .73.3.1 绿原酸纳米硒还原力的测定 .73.3.2 绿原酸纳米硒清除羟自由基的能力 .83.3.3 绿原酸纳米硒清除超氧阴离子的能力 .93.3.4 绿原酸纳米硒清除 ABTS+自由基的能力 .94 结论 .10参考文献 .11致谢 .12绿原酸纳米硒的制备
3、及其抗氧化性的研究I摘要绿原酸具有较好抗氧化，但其水溶性及稳定性较差。为了解决这一问题，本试验采用绿原酸直接还原制备绿原酸纳米硒（CGASeNPs）。选用荧光光谱法、紫外分光光谱法及傅里叶红外光谱法对所制得的 CGASeNPs 进行表征。并进一步通过对CGASeNPs 对羟自由基、超氧阴离子、ABTS +清除能力及还原力测定，评估CGASeNPs 抗氧化能力。结果显示，与 CGA 相比，CGASeNPs 的紫外吸收峰，及傅里叶红外光谱当中的-OH 特征峰均出现位移，说明已成功制备 CGASeNPs。荧光光谱显示所制备的 CGASeNPs 具有荧光性。抗氧化试验显示 CGASeNPs 清除自由基
4、及还原力均优于阳性对照组 VC 及 CGA。本试验结果表明 CGASeNPs 是一种高效的、稳定且带有荧光特性的新型抗氧化材料，这为纳米材料做为抗氧化剂的应用提供一定的理论依据。关键词：绿原酸；纳米硒；制备；抗氧化绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究IIAbstractChlorogenic acid has good oxidation resistance, but its water solubility and stability is poor. In order to solve this problem, chlorogenic acid nano selenium (CGASe
5、NPs) was prepared by direct reduction of chlorogenic acid. The prepared CGASeNPs were characterized by fluorescence spectroscopy, ultraviolet spectrophotometry and Fourier transform infrared spectroscopy. The antioxidant capacity of CGASeNPs was further evaluated by the determination of hydroxyl rad
6、ical, superoxide anion, ABTS+ scavenging ability and reducing power of CGASeNPs. The results showed that the UV absorption peaks of CGASeNPs and the -OH in Fourier transform infrared spectroscopy show that CGASeNPs have been successfully prepared compared with CGA. Fluorescence spectra showed that t
7、he prepared CGASeNPs were fluorescent. Antioxidant experiments showed that CGASeNPs scavenging free radicals and reducing power were better than those of positive control group Vc and CGA. The experimental results showed that CGASeNPs are antioxidant materials with efficient, stable and fluorescent
8、properties, which provides a theoretical basis for the application of nanomaterials as antioxidants.Key words: chlorogenic acid; selenium nanoparticles; preparation; antioxidant绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究1前言绿原酸（chlorogenic acid， CGA）分子式：C 16H18O9，又称咖啡鞣酸，是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，具有较多的生物活性，如抗病毒、抗菌、降血压等 1。由于它含有一定量的 R-OH 基
9、，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害 2。然而，绿原酸本身不稳定，难溶于水，易溶于乙醇及丙酮等极性有机溶剂，且它的分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚 3 个不稳定结构，如下图所示。这也导致了绿原酸的生物利用度低、稳定性差。因此，绿原酸在人体中的使用受到很大程度的限制。纳米科学技术的到来，给人类认识自然和改造自然开辟了新的窗口。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1-100nm)，或由它们作为基本单元构成的材料。纳米材料具有量子尺寸效应、表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应3，因此在光学、电学、热学、磁学
10、等多方面表现出大块材料所不能比拟的优越性，在分析检测、生物传感、药物传递、生物医学等众多领域都有广泛的应用。因此，研究如何利用纳米材料实现对绿原酸的负载和传递，促进绿原酸发挥药效，具有十分重要的意义。硒是动物体必不可少的微量元素之一，化学符号是 Se，一种非金属。硒有提高免疫力、预防癌症、抗氧化、拮抗有害重金属、调节维生素吸收与利用等作用4。但是硒的营养剂量和可耐受的最高摄入量之间的范围很窄，容易引起硒中毒 5。纳米硒不仅有很高的生物利用率和生物活性，而且毒性很低，是目前被发现的毒性最低的硒形式 5。本试验运用纳米技术将不稳定的利用价值高的绿原酸修饰在低毒、高生物活性的纳米硒上，既可以克服绿原
11、酸不稳定的缺点，又能克服无机硒和有机硒毒性大这一缺点。随后用荧光光谱法、紫外分光光度法及傅里叶红外光谱法对 CGASeNPs 进行表征，试验结果说明我们获得了稳定的带有荧光特性的 CGA 修饰的纳米硒材料。由于绿原酸和硒均具有抗氧化的特点，我们对所制备的 CGASeNPs 的抗氧化性进行研究，确定我们所合成的 CGASeNPs 抗氧化能力与 CGA 对比有所提高，这说明绿原酸纳米硒有望成为一种高效的、稳定的新型抗氧化材料，为纳米材料做为抗氧化剂的应用提供一定的理论依据。绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究21 材料与方法1.1 材料与试剂亚硒酸钠 山东西亚化学工业有限公司绿原酸（CGA，纯度为
12、 98%） 上海源叶生物科技有限公司2 ,2-联氮 -二(3-乙基-苯并噻唑 -6-磺酸)二铵盐（ABTS +） 上海源叶生物科技有限公司维生素 C 上海蓝季科技发展有限公司 邻苯三酚 天津市大茂化学试剂厂盐酸 天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠 天津市大茂化学试剂厂无水乙醇 天津市大茂化学试剂厂双氧水 天津市大茂化学试剂厂过硫酸钾 天津市大茂化学试剂厂绿矾 天津永大化学试剂开发中心水杨酸 天津永大化学试剂开发中心磷酸氢二钠 天津永大化学试剂开发中心Tris-HCl 北京索莱宝科技有限公司三氯乙酸 天津市福晨化学试剂厂绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究3铁氰化钾 天津市福晨化学试剂厂三氯化铁 西
13、陇化工股份有限公司。1.2 仪器与设备超纯水机 厦门精艺兴业科技有限公司JD1000-2 电子天平 沈阳龙腾电子有限公司GPX-9248 干燥箱/培养箱（两用） 上海跃进医疗器械有限公司HH-数显恒温搅拌循环水箱 上海圣科仪器设备有限公司CL-3 型恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司UV-5200PC 紫外可见分光光度计 上海美析仪器有限公司970CRT 荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司YP-2 压片机 上海山岳科学仪器有限公司IS5 傅里叶红外光谱仪 上海力晶科学仪器有限公司TGL-16GB 台式离心机 上海书培实验设备有限公司TDL-5-A 低速大容量离心机 上海安亭科学仪
14、器厂SB-3200DTDN 超声波清洗机 宁波新艺生物科技服份有限公司BDC-215KS 电冰箱 青岛海尔股份有限公司2 试验方法2.1 绿原酸纳米硒的制备有研究表明，CGA 溶解在 50%的乙醇中并在 4下保存最稳定 7。因此，我们精密称取一定量的纯度为 98%的 CGA、亚硒酸钠，将绿原酸溶于 50%的乙醇中，亚硒绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究4酸钠溶于超纯水中，将配制的 25 mM 绿原酸与 0.1 M 亚硒酸钠按一定的比例在 450 r/min 转速及室温下搅拌在一起直至溶液颜色由无色变为砖红色后停止搅拌，离心洗涤之后，重新溶解在 50% 醇溶液中，4下过夜保存 5-6。这种方法
15、使得 CGA 修饰在纳米硒材料上，制得均一稳定的 CGASeNPs 溶液。2.2 绿原酸纳米硒的表征2.2.1 紫外分光光度法 制后的 CGASeNPs 在 5000 r/min 的转速下进行离心，弃上清液，所得的沉淀即为 CGASeNPs，再用 50% 乙醇溶解成样液。采用紫外可见分光光度法在 200-600 nm 的波长范围内对样液进行波谱扫描 8，以 50%乙醇做基准线校正液，将 CGA醇溶液与 CGASeNPs 样液的紫外光谱图进行对比。2.2.2 傅里叶红外光谱分析法配制后的 CGASeNPs 在 5000 r/min 的转速下进行离心，弃上清液，所得的沉淀即为 CGASeNPs。将
16、所得沉淀的离心管用保鲜膜包裹后放入恒温干燥箱内进行干燥 24h，用溴化钾压片后，用红外光谱仪对其进行红外分析。在 400-4000 cm-1 范围内分别对干燥后的 CGASeNPs 和 CGA 进行红外波谱扫描，记录其红外光谱 9。2.2.3 荧光光谱法配制后的 CGASeNPs 在 5000 r/min 的转速下进行离心，弃上清液，所得的沉淀即为 CGASeNPs。再用 50%乙醇溶解所得沉淀制成样品溶液。以最大激发波长ex=350nm激发 , 在 380-600 nm 之间检测最大发射波长 em处的荧光强度值, 激发和发射的狭缝宽度均设定为 10 nm10-11。2.3 绿原酸纳米硒抗氧化
17、能力测定2.3.1 还原力的测定分别取 20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的 CGASeNPs溶液 1 mL 样品溶液于试管中，加入 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液 1.25 mL (pH = 6.6)和 1%的铁氰化钾溶液 1.25 mL，混匀后于 50 恒温水浴锅中水浴加热 20 min 后，快速冷却，再加入 1.0 mL 10% 三氯乙酸，以 3000 r/min 的转速离心 10 min，取上清液 0.5 mL，加入 0.1% 的三氯化铁溶液 0.25 mL，再加 1.75 mL 蒸馏水，充分混匀后，在700 nm 处测定其吸光值 Ai，
18、空白对照以 1.0 mL 蒸馏水代替样液测吸光度 A013。以绿原酸纳米硒的制备及其抗氧化性的研究5Vc 及 CGA 为阳性对照，进行 CGA、CGASeNPs 与 Vc 的还原力大小对比。2.3.2 清除羟自由基能力的测定分别取 20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的 CGASeNPs溶液 1.0 mL 样品溶液于试管中，依次加入 1.0 mL 6 mmol/L 硫酸亚铁、1.0 mL 6 mmol/L 双氧水，混匀后静置 10 min，再加入 1.0 mL 6 mmol/L 水杨酸，混匀后静置30 min，于 510 nm 处测吸光度 Ai。以
19、1.0 mL 蒸馏水代替水杨酸测吸光度 Aj，空白对照以 1.0 mL 蒸馏水代替样液测吸光度 A011-13。以 Vc 及 CGA 为阳性对照，计算羟自由基的清除率 E：E =（A 0-Ai+Aj）/ A02.3.3 清除超氧阴离子自由基能力的测定此试验是利用邻苯三酚的自氧化反应测定 CGA 对其产生的超氧阴离子的清除作用，在碱性的条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成有色物质，我们通过加入样品溶液阻止中间产物的积累，吸光度降低，以 Vc 作为阳性对照，研究所制得的CGASeNPs 的清除超氧阴离子能力是否提高。取 pH = 8.2，2.25mL，50 mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液
20、于试管中，加入 1.0 mL 蒸馏水，于 25水浴加热 20 min，再分别取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的 CGASeNPs 溶液 1 mL于试管中，再加入 25 mmol/L 的邻苯三酚 0.25 mL 混匀，在 25水浴中反应 6 min，立即滴加 0.5 mL 10 mmol/L 的盐酸终止反应，在 320 nm 下测定吸光值 Ai，以 1.0 mL蒸馏水代替邻苯三酚测吸光度 Aj ，以 1.0 mL 蒸馏水代替 CGASeNPs 溶液测吸光度 A011-14。以 Vc 及 CGA 为阳性对照，计算超氧阴离子自由基的清除率 E。E =（A 0-Ai+Aj）/ A0
