1、1油橄榄叶提取物橄榄苦苷的酶法水解产物及其抗氧化能力的研究王 强 1,2 王仲明 1,2 谢跃杰 1,2 李园园 1,2 王 波 3 姚新民 4 黄梅桂 2,5 (重庆第二师范学院生物与化学工程学院 1，重庆 400067）(重庆第二师范学院脂质资源与儿童日化品协同创新中心 2，重庆 400067)(甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 3，兰州 737100)(重庆金峡油橄榄开发有限公司 4，重庆 404600)(南京林业大学轻工与食品学院 5，南京 210037）摘 要： 评价了木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、- 葡萄糖苷酶（A. niger）、-葡萄糖苷酶（来自杏仁）、半纤维素酶
2、（A. niger）、纤维素酶等 7 种酶对橄榄苦苷水解程度、水解产物（橄榄苦苷元、烙醇苷元、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇）的影响，采用三价铁离子还原法、DPPH体系对油橄榄叶提取物及其水解产物抗氧化活性进行研究，以 VC、BHT、橄榄苦苷、羟基酪醇（对照品）等为对照。结果表明：酶法辅助提取和水解处理可以显著提高产品中橄榄苦苷元、烙醇苷元、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇的含量，其中，-葡萄糖苷酶（A. niger）水解效果最佳。此外，经过酶水解后油橄榄叶提取物水解液（A. niger）的还原能力明显高于 VC（2.12 倍）和 BHT（
3、5.95 倍），其清除 DPPH的能力也高于VC（ 1.29 倍）和 BHT（3.38 倍）。结论对油橄榄叶提取物酶解制备特定水解产物的工业化生产提供了有效借鉴。关键词：油橄榄叶；提取物；水解产物；-葡萄糖苷酶；抗氧化能力Assessment of enzymatic hydrolysis produces and its antioxidant activities of oleuropein in olive leaf extractsWang Qiang1,2 Wang Zhongmin1,2 Xie Yuejie1,2 LI Yuanyuan1,2 Wang Bo3, Yao Xinm
4、in4 Huang Meigui2,5(College of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education1, Chongqing 400067 )(Cooperative Innovation Center of Lipid Resources and Childrens Daily Chemicals, Chongqing University of Education2, Chongqing 400067 )(College of Light Industry and Food Science
5、, Nanjing Forestry University3, Nanjing 210037)(Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Central Laboratory of Technical Center4, Gansu 730010 )基金项目：重庆市社会事业与民生保障科技创新专项（cstc2017shms-xdny80081），北京食品营养与人类健康高精尖创新中心开放基金（20171044）,重庆市创新创业示范团队支持计划（201618793）,重庆第二师范学院科技协同创新平台建设项目（2017XJPT01）收稿日期：20
6、17-12-03作者简介：王强，男，1982 年出生，副教授，抗氧化自然资源利用与生理生化通信作者：黄梅桂，女，1983 年出生，副教授，食品化学2(College of Light Industry and Food Science, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)Abstract: The influence of seven different enzymes (papain, alkali protease, neutral protease, -glucosidase (A. niger), -glucosida
7、se(almonds), cellulose (A. niger) and cellulase) on oleuropein hydrolysis capacity and its hydrolysis produces (oleuropein aglycon, ligstroside aglycon decarboxymethyl oleuropein aglycon, decarboxymethyl ligstroside aglycon, and hydroxytyrosol) were investigated. The antioxidant capacities were anal
8、yzed by FRAP and DPPH compared with VC, BHT, oleuropein and hydroxytyrosol. The hydrolysis capacity of -glucosidase from A. niger was highest and selected. Further the influence of -glucosidase from A. niger on hydrolysis produces was analyzed. The reduce power of hydrolysis produces of olive leaf e
9、xtracts was higher than VC and BHT (2.12 times and 5.95 times, respectively). The DPPH scavenging capacity of hydrolysis produces of olive leaf extracts was higher than that of VC and BHT (1.29 times and 3.38 times, respectively).Key words: olive leaf; extracts; hydrolysis produces; -glucosidase; an
10、tioxidant中图分类号：S565.7 文献标志码：A 文章编号： 橄榄苦苷（oleuropein，OE）及其苷元（aglycon）是一种天然裂环烯醚萜苷类多酚化合物，广泛存在于各种木犀科的木犀榄属、丁香属、女贞属等植物中。20 世纪 50 年代初，OE 一直被认为是橄榄油中的一种苦味素；1960 年，Panizzi 等 1首次从橄榄油中苦味成分中分离出 OE；1970 年，Inouye 等 2首次从女贞树提取并纯化了橄榄苦苷，并明确了 OE 结构，其结构中含有 6 个羟基（如图1 所示），具有多种药理活性，近年来研究备受关注。 HOOOOOHHOHOHOOOOHHOHOOHOOHOHOO
11、OHHOHOOHO图 1 橄榄苦苷、橄榄苦苷元 Oleuropein aglycon、烙醇苷元 Ligstroside aglycon、去( 羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基) 烙醇苷元的基本结构研发发现，橄榄苦苷以油橄榄及其叶中含量最高 3-5。油橄榄（ Olea europaea L.）属木犀科（Oleaceae）木犀榄属（Olea ）常绿乔木，是世界著名的木本油料兼果用树种，栽培品种有较高食用价值。采用油橄榄提取橄榄苦苷及其苷元成本太高 3,4。研究发现油橄榄叶含有的抗氧化活性成分较之橄榄油更为突出，主要有橄榄苦苷、羟基酪醇（hydroxytyrosol，HT）、黄酮类、木酚素类和咖啡
12、酰苯乙醇苷类等多酚类化合物 3-7；油橄榄叶提取物早已被地中海地区的人们当作民间医药来治疗发烧和其他疾病如疟疾等 8，油橄榄叶提取物具有强的抗氧化活性和抑菌活性 9。现代药理实验研究表明，油橄榄叶中含有丰富的活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗肿瘤和降血糖等活性，并逐渐应用于医药、保健食品、化妆品等行业且应用前景广阔 8-12。3我国甘肃陇南、重庆奉节、四川广元等地均大力推广油橄榄种植，但均缺乏除橄榄油外其它副产物的深加工和综合利用，油橄榄叶及榨油所产生的果渣和废液不仅没有得到充分利用，还造成了环境污染。在油橄榄果生长过程中，会产生大量的副产物油橄榄叶，每年每棵油橄榄树修剪过程就
13、要产生超过 25 kg 的嫩枝和树叶。长期以来，对油橄榄叶的利用还很不充分。虽然国外已有将油橄榄叶提取物用于食品、药品和化妆品等行业的应用报道，国内也有一些将橄榄叶加工成茶饮料、油橄榄叶挂面等报道，但均直接利用原料叶或粗提物；对如何有效提取分离油橄榄叶中裂环烯醚萜类化合物，拓展该类化合物的应用范围，还有做大量的工作要做。油橄榄叶中橄榄苦苷的提取方法通常有酶提取法、醇浸提法、索氏抽提法、微波辅助提取法、超临界 CO2 萃取法等，但是均对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷及其水解产物的组成未知 13-18。本试验通过在橄榄苦苷提取的过程中添加各种水解酶，探索水解酶对提取过程及其水解产物的影响机制，在此基础上
14、，分析油橄榄叶提取物中橄榄苦苷及其水解产物的组成和抗氧化能力，以期对油橄榄叶有效综合利用提供一定的借鉴。1 材料与方法1.1 材料与仪器供试油橄榄叶：从重庆奉节县油橄榄种植基地采集（试验采用完全随机设计，选取不同株生长健壮、长势一致的生叶为试材，均为成熟叶，即非嫩叶或老叶）；橄榄苦苷、羟基洛醇对照品(纯度 98%) 成都曼思特生物科技有限公司； 1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH ）、维生素 C（VC ）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、-葡萄糖苷酶（A. niger）（100 U/mg）、- 葡萄糖苷酶（来自杏仁）（1
15、00 U/mg） 美国 Sigma-Aldrich 公司；半纤维素酶（ A. niger）（1.5 U/mg） 北京索莱宝科技有限公司；木瓜蛋白酶（100 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg ） 诺维信（中国）生物技术有限公司；纤维素酶（45 U/mg） 阿拉丁试剂 (上海)有限公司；其他化学试剂均为分析纯。JYL-C012Joyoung/九阳料理机；高压均质机； DHG-9240A 电热恒温鼓风干燥箱、 DK-8D 三孔电热恒温水槽、722S 型可见分光光度计； PHS-3C 型 pH 计；KH-5200DE 型数控超声波清洗器。1.2 方法1.2.1
16、油橄榄叶处理方法蒸馏水清洗，室内自然阴干，60 干燥，粉碎过 40 目筛，于 4 保存备用。1.2.2 油橄榄叶中橄榄苦苷的提取定量称取 1.0 g 油橄榄叶干燥粉末，加入 40 mL 甲醇水溶液（甲醇与水的比例为 4:1，v/v），搅拌群均匀后，置于超声波清洗器中超声提取 24 h；冷却至室温，离心（ 1500g，15 min），取上清液，过 0.45 m滤膜，计算油橄榄叶中橄榄苦苷提取率 15。1.2.3 酶法水解选取木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、-葡萄糖苷酶（A. niger）、- 葡萄糖苷酶（来自杏仁）、半纤维素酶（A. niger）、纤维素酶等 7 种酶，称取相同酶活力（1.5
17、 U/mg）的各种酶均在4最适温度和 pH 条件下进行酶解实验（即将上述酶分别加入“1.2.2”实验过程中）。分别于1、2、4、6、8、10、12 h 将酶解体系放置于20条件下终止酶解反应，分析各酶解阶段的酶解率及产物组成。酶解率（%）= （m 橄榄苦苷水解前 m 橄榄苦苷水解后 ） m 橄榄苦苷水解前 100%1.2.4 LCMS/MS 产物组成分析色谱条件：色谱柱为 UPLC BEH C18（50 mm 1.0 mm, 1.7 m）；流动相：A 为 0.2 %（v/v）甲酸乙腈， B 为 0.2 %（v/v）甲酸水；流速 0.15 mL/min；进样量： 2.0 L；柱温 35 。质谱条
18、件：采用电喷雾离子源（ESI），在负离子电离模式下选用 MRM 扫描方式进行质谱测定；毛细管电压 4 kV，喷雾压力 5 kV，辅助加热气：氮气，流量 8 L/min；加热温度：300 ；其他质谱条件见表 1。表 1 LC-MS/MS 分析橄榄苦苷水解产物的定性和定量参数成分 前体离子(m/z) 定量离子对(m/z) 目标产物离子(m/z)橄榄苦苷 539.2 539.2307.1 275.0橄榄苦苷元 Oleuropein aglycon 377.1 377.1275.1 307.0烙醇苷元 Ligstroside aglycon 361.1 361.1291.1 259.0去(羧基甲基)橄
19、榄苦苷元 319.1 319.159.0 123.0去(羧基甲基)烙醇苷元 303.1 303.159.1 137.0羟基酪醇 153.0 153.0123.0 108.01.2.5 油橄榄叶提取物水解前后的抗氧化能力的半数抑制质量浓度（IC 50）测定1.2.5.1 铁离子还原法（FRAP） 参考 Benzie 等报道的方法 20。取 100 L提取物，加 1.8 mL TPTZ工作液由 0.3 mol/L 醋酸盐缓冲液 25 mL（pH 3.6），10 mmol/L TPTZ 溶液 2.5 mL，20 mmol/L FeCl3 溶液 2.5 mL 组成，混匀后 37 反应 15 min，测
20、定吸光度 A593 nm，以 1.0 mmol/L FeSO4 为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的 FeSO4 的毫摩尔数表示。1.2.5.2 清除 DPPH 自由基（DPPH）的测定 参考 Liu 等 21方法进行，将 4 mL 的 95%DPPH乙醇溶液（10 4 molL1）与提取物 500 L 混匀后测定吸光度 A517 nm，采用 IC50 评价橄榄苦苷及其水解产物抗氧化能力大小。1.2.6 统计分析实验数据以 xSD 表示（n=3），用 Duncan 进行差异显著性检验（P 0.05），Origin 8.0 软件进行作图。2 结果与分析2.1 LC-MS/MS 测定橄榄苦
21、苷及其水解产物0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5Time, min02004006008001000120014001600Intensity1 23 4 56TOF MS25图 2 LC-MS/MS 测定油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷及其水解产物的总离子流色谱图（注：16 分别表示橄榄苦苷、橄榄苦苷元 Oleuropein aglycon、烙醇苷元 Ligstroside aglycon、去( 羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇）LC-MS/MS 测定油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷及其水解产物
22、（橄榄苦苷元 Oleuropein aglycon、烙醇苷元 Ligstroside aglycon、去( 羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇）的总离子流图如图 2 所示，其线性范围、回归方程和相关系数参数如表 2 所示。初始提取物（即未加水解酶）中各目标物含量如表 2 所示。由此可见，各成分在所述线性范围内线性关系良好（R 20.999），本方法简单、快速、灵敏，适用于橄榄苦苷及其水解产物的定性和定量分析。表 2 定量分析橄榄苦苷及其水解产物的的线性范围、回归方程和相关系数参数成分 线性范围（g/mL） 回归方程 R2 提取物含量（g/mL）橄榄苦苷 0.0120 y=3
23、2401x+120.34 0.9993 10.04橄榄苦苷元 Oleuropein aglycon 0.0015 y=25601x+24.67 0.9998 /烙醇苷元 Ligstroside aglycon 0.0015 y=15491x+19.01 0.9991 /去(羧基甲基) 橄榄苦苷元 0.0015 y=10065x+81.45 0.9998 /去(羧基甲基) 烙醇苷元 0.0015 y=56310x+150.05 0.9997 /羟基酪醇 0.0015 y=13850x+58.12 0.9991 0.182.2 酶种类的筛选分别采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、-葡萄糖苷酶（
24、来自 A. niger）、- 葡萄糖苷酶（来自杏仁）、半纤维素酶（A. niger）、纤维素酶等 7 种酶进行酶解实验，分析了不同酶对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷水解程度的影响，结果如图 3 所示。7 种酶对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷的水解效果顺序为：-葡萄糖苷酶（ A. niger）- 葡萄糖苷酶（来自杏仁）半纤维素酶（A. niger）木瓜蛋白酶中性蛋白酶纤维素酶碱性蛋白酶。本研究发现，各种水解酶在醇提过程中可以不同程度提高橄榄苦苷的水解率，其原理在于各种水解酶作用于原料分子中，促进原料中的橄榄苦苷的释放；其中以 -葡萄糖苷酶的酶促水解效果最佳。木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等蛋白酶均主要作
25、用于蛋白质或肽，文件报道这些蛋白酶能使植物细胞壁和细胞膜结构被破坏，释放活性成分 15,19，而本文研究发现这种效果较弱。6图 3 非酶处理与不同种酶处理对橄榄苦苷水解率的影响2.3 -葡萄糖苷酶（A. niger ）处理对橄榄苦苷水解产物的影响重点分析了 -葡萄糖苷酶（A. niger）处理对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷水解产物的影响，如图4 所示。随着水解时间的延长，油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷的含量持续下降，其中 04 h 时间段橄榄苦苷含量迅速下降，该时间段油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷元 Oleuropein aglycon 浓度迅速上升，4 h 后趋于平衡；而随着油橄榄叶提取物水解液
26、中橄榄苦苷的含量迅速下降（04 h 时间段），水解产物烙醇苷元 Ligstroside aglycon、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元和羟基酪醇等浓度显示出不同程度的增加（如图 4 所示）。油橄榄叶提取物经过酶法辅助提取和水解处理后，其橄榄苦苷元 Oleuropein aglycon、烙醇苷元 Ligstroside aglycon、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基) 烙醇苷元、羟基酪醇含量分别为：5.35、0.12、0.28、0.02、0.76 g/mL；与初始提取物（即未加水解酶）中目标物含量相比（如表 2 所示），酶法辅助提取和水解处理可以显著提高产品中功效成分的
27、含量。油橄榄叶提取物酶解工艺与传统的酸解、碱解工艺相比，酶解方法条件较温和，整个过程减少了酸、碱催化剂的使用，是一种可以进一步开发利用的水解方式 22,23。图 4 -葡萄糖苷酶（ A. niger）处理对橄榄苦苷水解产物的影响2.4 油橄榄叶提取物水解前后的抗氧化能力比较分析7注：横坐标数字 14 分别表示样品油橄榄叶提取物（水解前）、油橄榄叶提取物（水解后）、橄榄苦苷（标准品）、羟基酪醇（标准品）；不同小写字和大写字母分别表示组间差异显著，P0.05 。图 5 油橄榄叶提取物、橄榄苦苷及其水解产物抗氧化能力的半数抑制质量浓度（IC 50）评价提取物及其水解产物体外抗氧化能力，常选择自由基清
28、除率达到 50%时测试对象的浓度作为评价指标，即半数抑制浓度 IC50。IC 50 值越小，表示抗氧化剂清除自由基的能力越强，反之，IC 50值越大，表示抗氧化剂清除自由基的能力越弱。采用三价铁离子还原法、DPPH体系对油橄榄叶提取物（即未加水解酶）及其水解产物（即添加 -葡萄糖苷酶（A. niger）后的稳定水解产物）抗氧化活性进行研究，以 VC、BHT、橄榄苦苷、羟基酪醇为对照。如图 5 所示，在 FRAP 法中，羟基酪醇还原 Fe(3+)的能力最强（IC 50=4.3 g/mL），还原 Fe(3+)的能力顺序为：羟基酪醇油橄榄叶提取物水解液（A. niger）橄榄苦苷VC BHT油橄榄叶
29、提取物（未加水解酶） ；其中油橄榄叶提取物水解液（ A. niger）还原Fe(3+)的能力与羟基酪醇较为接近。油橄榄叶提取物水解液（A. niger）的还原能力要大于VC（ 2.12 倍）和 BHT（5.95 倍），油橄榄叶提取物水解液（ A. niger）的清除 DPPH的能力要大于VC（ 1.29 倍）和 BHT（3.38 倍）。此外，当油橄榄叶提取物及其水解产物和对照品对 DPPH的清除率达到 50%，羟基酪醇浓度最小，油橄榄叶提取物水解液（A. niger）的浓度次之，油橄榄叶提取物水解液（A. niger）的浓度最大。 油橄榄提取物（即添加 -葡萄糖苷酶（A. niger）的抗氧化
30、能力弱于羟基酪醇而强于橄榄苦苷，其可能原因在于所提取的提取液中均含有该两种成分及其水解产品，各成分之间存在协同抗氧化作用。3 结论3.1 建立了油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷及其水解产物烙醇苷元 Ligstroside aglycon、去(羧基甲基 )橄榄苦苷元、去( 羧基甲基)烙醇苷元和羟基酪醇的定量分析方法。3.2 七种酶对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷的水解效果顺序为：-葡萄糖苷酶（来自 A. niger）- 葡萄糖苷酶（来自杏仁）半纤维素酶（A. niger）木瓜蛋白酶中性蛋白酶纤维素酶碱性蛋白酶。3.3 采用 -葡萄糖苷酶（来自 A. niger）处理油橄榄叶提取物，因其高效的抗氧化活性使
31、其更适8合应用于食品、化妆品和药品等领域，具有广阔的市场空间，因此酶降解油橄榄叶提取物具有显著的市场应用价值。参考文献1 PANIZZI L, SCARPATI M L, ORIENTE E G. Structure of oleuropein bitter glycoside with hypotensive action of olive oil. Note II. J. Gazzetta Chimica Italiana, 1960, 90: 1449-1485.2 INOUYE H, YOSHIDA T, TOBITAS, et al. Absolute struktur des ol
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