1、体外肝脏功能支持的问题及前景摘要本文综述了人工肝的特点，包括利用体外装置进行“人工肝” 或 “生物型人工肝”进行肝脏治 疗。文献数据分析显示，需要进一步进行生物医学研究，寻找和选择最合适肝细胞来源、生物反应器和生物材料。生物反应器和生物材料是“生物人工肝” 的基本 组成。在综合考虑 多种肝脏替代方法的优缺点之后，在治疗肝脏疾病时，我们可以进行更有效的评估，可以发展出更有效的医疗技术。关键词：生物型人工肝，肝细胞，生物材料，肝功能不全引言肝功能障碍可以发生于多种病理状态下，会出现严重的代谢紊乱，严重时会出现“毒血症”。全球每年出现肝功能不全患者的数量达到约二百万人,标准的内科治疗方法不令人满意，
2、平均死亡率约为 80%。肝移植是肝衰竭治疗的“黄金标准” 。每年 , 在美国大约进行6000 例肝移植, 而在英国大约有 600-700 例。然而，肝移植的效果也受限于手术风险、术后并发症、免疫抑制治疗以及缺乏足够的肝脏供体【1】。关于内源性或外源性毒物清除的方法，很多都是类似于血液透析、血浆置换、血液吸附等体外血液净化方式【2】，这些方法只替代了肝脏的解毒功能，而对于肝脏代谢过程并没有影响。而一般这些替代治疗方法的治疗效率并非远高于常规治疗。已知的治疗方法均存在各种限制，同时缺乏有效性，因此需要改进及发展新的治疗方式，以替代肝脏进行解毒以及正常的代谢。在这种背景下，出现了更多的关于肝脏替代的
3、研究，利用体外的“肝脏辅助” 装置，进行解毒治疗,同时改善代谢功能。其中一种有前途的方法，在体外装置上利用肝脏细胞或细胞碎片，形成 “生物人工肝”设备，进行肝脏替代【3,4】。 “人工肝” 设备发 展面临的已知困难，包括进一步明确肝脏内复杂的生化反应过程，设备中复杂的肝细胞的提取、培养、储存技术，以及高昂的费用问题。在综合考虑多种肝脏替代方法的优缺点之后，在治疗肝脏疾病时，可以进行更有效的评估，可以发展出更有效的肝脏替代技术。1. 肝脏治疗的传统方法及“人工肝” 在肝功能衰竭的发展过程中，血氨、芳香族氨基酸、胆红素、硫醇、酚类化合物、脂肪酸和一些其他物质浓度增高，是重要的致病因素【5、6】。有
4、鉴于此，最初的“人工肝” 如血 浆置换、血液透析、血液吸附等治疗的目的都是为了清除这些物质。 1.1 血浆置换 最初，血浆置换用于治疗疾病，清除血液中的自身抗体以及免疫复合物，后来其临床应用范围逐渐扩大。Chang【7】第一个成功的 应用血浆置换治疗肝昏迷患者。随后相关研究明显增加。研究显示，在急性肝衰竭患者，血浆置换治疗的临床有效率在 30-60%【8、9】，而生存率在 20%左右。在爆发性肝衰竭，血浆置换者的生存率在 10%左右。尽管血浆置换临床应用广泛，但其治疗机制仍不完全清楚【10】。用于标志血浆的实验室指标仍难以确定。甚至有研究发现，对急性肝衰竭进行血浆置换治疗，利用血浆中提取出的人
5、血白蛋白或异体血浆，反而不利于损伤肝脏的恢复【11】。1.2 透析、滤过和吸附 有研究成功的应用了血液透析治疗慢性肝功能衰竭，因此人们希望把这种方法应用于肝衰竭。然而，虽然能够降低血氨，并且在透析液中检测到血氨，但临床观察到的首要结果仍不理想【12】。结果提示，血氨升高在肝昏迷的发病机制中占有比较重要的地位，但也指出，并非所有导致肝昏迷发病的物质都可以通过透析清除。一些学者认为，这一结果是因为滤膜对中分子物质的通透性不足所导致。更多的研究聚焦于新型材质的聚丙烯腈透析膜，它对中分子物质的通透性良好。例如，应用 RP-6, Opolon【13】膜进行血液透析时，对 39 例肝昏迷患者中的 17 位
6、患者有效，有一段时间 的意识复苏伴血液中中分子物质浓度的下降。然而，77%的病死率并未显示出与非血液透析组的差异。使用这种方法的局限还包括各种并发症：低血压和血容量减少,心律不齐，酸中毒、贫血、电解质失衡、凝血系统的变化，以及肝素和机械对血细胞的影响【2,14】。随着分子量的增加，弥散通过半透膜的物质会减少。中分子量的物质不容易利用浓度梯度差通过透析膜，而增加滤过压可以增加其清除。基于这种想法，人们进行了血液滤过治疗，这一方法通过增加滤过压力而清除循环中的溶质。当血液滤过用于肝脏衰竭时，患者的生存率为 60%【15】。在标准血液透析治疗时，可以通过增加清除液体的量，从而增加治疗效率，原因是由于
7、对流和滤过量的增加。这一过程可以看做是透析和血液滤过的结合。 “血液透析滤过”利用特殊的透析器，进行高流量的超滤。在治疗后，尽管中分子量物质清除增加，部分临床症状改善，但需要注意的是，应用高通量滤膜会导致一些重要生理物质的丢失（如激素、维生素、氨基酸等）。这些物质丢失的结果尚缺少临床观察【16】。分子吸附再循环系统（MARS），利用透析方法治疗肝衰竭，其原理为“白蛋白透析” 。这种方法可以清除血液中的蛋白结合毒素及水溶性毒素【17、18】。白蛋白透析液经过活性炭及离子交换树脂而“再生” ，这使得一定量的白蛋白在整个治疗过程中反复应用而不降低治疗效率。根据病情的程度，MARS 可 应用 3-5
8、天，每次治疗 2-6 小时。MARS的应用可以改善生命体征，减轻神经系统症状，但生存率无明显增加【19】。然而，同其他滤过方法一样，MARS 也会清除血液中的一些重要的细胞因子如 IL-6，TNF 等，而这些细胞因子可能参与了肝细胞再生过程【20】。另外，需要注意的是，MARS 并不是一个独立的 设备，它必须与其他血液透析设备联合应用。它的费用昂贵，尤其是耗材（每套数千欧元），极大的限制了其在临床的广泛应用。然而，白蛋白透析在目前的体外肝脏替代技术中，仍处于领先地位。为了减少白蛋白透析的成本，俄罗斯自行研发，生产白蛋白及吸附剂【21】。他们对 15 例因不同病因导致的肝功能衰竭的病人进行了一种
9、生物型人工肝的治疗【22】，实验发现这种方法治疗效率高，在所有患者，细胞破坏及胆汁淤积的生物标志物均明显下降，而内源性中毒征象也均好转。在治疗过程中，没有副反应的报道，而病死率为 6.7%。这种命名为“普罗米修斯系统” 的体外技术，同样利用了吸附的原理，其吸附的是透过半透膜的血浆中的白蛋白。临床试验发现，与 MARS 系统相比，这种方法具有更好地治疗效果，但对于血流动力学状态并没有更好的改善作用【23】。关于血液吸附治疗肝衰竭的初始研究，显示了其可以降低中分子量、疏水性分子及其他毒物的血液浓度【24】，病人生存率上升到 65%【25】。在病毒性乙型肝炎导致的肝衰竭中，血液吸附可以短期（1-2
10、天）降低总胆红素和直接胆红素，但对整体临床预后并没有明显改善【26】。其作者的观点认为，血液吸附对于肝衰竭治疗无效，原因可能为吸附剂表面吸附了一些对于肝脏再生非常重要的肽类和代谢产物。事实上，在吸附治疗后分析活性炭表面的化学物质，发现了茚三酮的存在,另外还有 Lowry-positive 化合物、醛糖、山梨糖、过氧化物、有机酸和中等分子量的高生物活性的多肽等【27】。慢性肝衰竭病人进行血液吸附治疗的长期研究发现，血液吸附治疗可以改善临床症状，与治疗前相比，蛋白质代谢、肝酶活性以及中枢系统损害等情况都有所改善【28】。血液灌流可以延长慢性肝病的临床缓解期，尤其对酒精性肝病的患者更为有效。一般来说
11、，文献数据分析表明，血液吸附对于肝衰竭治疗的积极作用，是因为其清除了血液内的某些氨基酸、酚类、脂肪和胆汁酸以及胆红素等物质。选择性的清除这些物质肯定对疾病有利，但并不能解决肝衰竭治疗的问题。因此，尽管对临床指标有改善，但透析滤过的方法并不能增加病人的生存率【29】。这可能是因为血液吸附的副作用导致的，包括血液体外循环期间补体激活、白细胞减少、全身炎症反应、凝血功能障碍等。另外一点重要的不足之处，在于这些方式清除了一些参与肝细胞再生的激素和生长因子【20】。这些体外肝脏替代技术都是替代了肝脏的清除功能，而对肝衰竭造成的其他功能缺失没有治疗作用。在这种情况说明非生物型人工肝有着不可避免的不足。如今
12、，人们清晰的认识到，需要创造一种具有生理活性的肝脏辅助系统，同时具有肝脏的代谢和解毒功能【30】。一种合理的解决方法，是用不同的肝脏替代方法组合在一起，来治疗肝功能衰竭【31】。 2. 设计和创造“生物型人工肝” 自上世纪 80 年代以来，新的肝脏替代方法开始出现，并在近年来发展迅速。这种方法利用血液灌流的形式，进行生物治疗，在体外循环中利用培养出的细胞或组织片段，来实现肝脏功能，代丧失了功能的肝脏。这种方法所采用的设备被称为“人工肝” 或“生物型人工肝” 。它 们把患者的血液或血 浆通过含有代谢活性物质的生物反应器，实现对内源性或外源性物质的解毒和生物转化，并合成蛋白子、尿素、甘油三酯等。一
13、种相对简单的生物型人工肝，是应用猪的肝脏，其胞液中含有线粒体和微粒体，用于肝衰竭时的解毒治疗【31】。模型实验和动物实验证明了此种方法的效果，具有很强肝脏解毒作用，减少了疾病的过程和强度，使得血液各种生化指标趋于正常。在临床前研究中进行的生化、血液和免疫监测中，均证明了这种方法的安全性和有效性。Seglen【32】等人利用含有胶原酶和透明质酸酶的溶液，对完整的肝脏进行处理，从而中断肝细胞之间的连接；Berry 和 Friend 等【33】，利用结合酶和机械分离的方法，来实现这一过程，实现肝细胞之间的分离。这一成果是创造生物型人工肝中，重要的一步。改善低温存储技术，使得肝细胞能够低温贮藏，使得肝
14、细胞在体外能够存活更长时间，为生物型人工肝的临床和实验研究提供了可能性。当前，各种临时性生物肝脏替代系统之间最重要的不同包括：细胞的来源（种类）；在肝细胞灌注时，生物反应器与血液或血浆接触的环境；以及细胞固定在生物反应器上的方法。一些设备研发人员认为，应该把这种生物技术与所有常规肝脏体外解毒治疗方式相结合，包括血液吸附、透析、滤过和置换等。2.1 肝细胞的来源 传统的肝脏病学领域认为，肝脏大部分切除后，只要残余肝脏体积在 20%以上，就可以维持正常的肝脏功能。这大约是 200g，21010 个肝细胞。然而，临床研究显示，在体外生物型人工肝中应用同等数量的肝细胞，虽然可以改善生化指标及临床症状，
15、但并不能改善总体生存率。除了细胞数量，一些其他因素如肝细胞的活性及功能也会影响治疗效果。 2.1.1 原代人类肝细胞 理论上，对于体外生物型人工肝设备，原代人类肝细胞是最理想的选择，因为其安全性和生物活性均满足治疗需求。在体外人工肝设备比较原代人类肝细胞、人类胎儿肝细胞及猪肝细胞代谢的情况，结果显示，与猪肝细胞相比较，原代人类肝细胞对于血氨的清除能力和尿素氮的合成能力，分别是猪肝细胞的 2 倍和 3 倍【34】。同时,在人类胎儿肝细胞，利多卡因的新陈代谢比猪的肝细胞高 3.5 倍。体外人工肝设备使用人类原代肝细胞的缺点，包括增殖能力不强，生存期短（1-2 周）。在大多数情况下,人类原代肝细胞的
16、获得，是在肝硬化、肝纤维化、胆管炎等情况所手术切除的肝脏，所以肝细胞的数量和功能往往是不足的,并且细菌和病毒感染的风险很高。尽管肝脏具有再生的能力，但在体外进行肝细胞的培养是非常困难的。即使在最佳的培养基中，原代人类肝细胞在数小时内也会出现“去分化 ”，失去其特异的基因表达及相 应的功能。有一种方法是建立“原代人类肝细胞” 库，以储存人类肝细胞并严格控制其质量，已备“体外生物型人工肝” 使用。2.1.2 人类肝细胞系目前，唯一批准在临床体外人工肝设备上使用的人类肝细胞系是 C3A 肝细胞，它是通过克隆HepG2 细胞系获得的。然而，与原代猪肝细胞相比，C3A 肝细胞在解毒和代谢能力均较弱，而这
17、对于肝衰竭的病人恰恰是最重要的【36、37】。因此在临床体外人工肝系统使用 C3A肝细胞可能并不合理。人们采用各种方法来制备功能强、 “不灭” 的肝 细 胞系。Dolgikh【38】在综述中提到，传统方法制备“不 灭 ”肝细 胞包括逆 转录病毒转导肿瘤抗原 SV-40，它的产生与调节蛋白 Rb 及 P53 有关。也可以采用肝癌细胞在特定培养基进行培养。然而，需要指出的是， “不灭” 的肝细胞的功能可能是不完全的，并可能存在一些基因方面的风险。目前，更多的研究聚焦于从胚胎中获取或从多功能干细胞中培养，从而获得“不灭” 的人 类肝细胞【30】。2.1.3 原代猪肝细胞在体外生物人工肝系统中，原代猪
18、肝细胞应用的比较广泛，这是由于其提取及培养技术成熟，肝源容易获得且成本低。然而,这里仍然存在一些问题,主要是相关猪内源性逆转录病毒感染的潜在风险。一些研究表明, 猪内源性逆转录病毒可以感染人类肝细胞和其他体外培养的细胞【39、40】。由于这种风险的存在，欧洲的一些国家禁止使用原代猪肝细胞，限制了其在体外生物人工肝系统中的应用【41】。其他关于肝脏支持系统 Hepat Assist 的研究【42】，没有发现猪内源性逆转录病毒的传染。28 例患者应用这种设备治疗了 5 年，应用聚合酶链反应检测外周血单核细胞，并没有发现猪内源性逆转录病毒的感染。体外研究也表明，细胞膜的存在减少了猪内源性逆转录病毒感
19、染的风险。将猪的肝细胞和人的细胞共同进行培养，并未发现病毒的繁殖。这些结果认为，生物型人工肝系统中应用猪肝细胞会导致病毒感染这一说法是不正确的。根据美国食品药品管理局的要求，来源于某些特定品种猪的肝细胞，在适当保存的情况下，可以应用于人工肝设备【43】。这主要是因为，在病人血液流经进行异种肝细胞灌注时，有发生免疫反应的风险。另一个重要的 问题，是在灌流治疗时期，保护猪的肝细胞避免被人血中的免疫球蛋白所破坏。解决这一问题的途径，是通过控制滤膜的截留分子量，使得分子量在 100 kDa 左右的物质，可以通过滤膜，如白蛋白(60 - 80 kDa)等，但人免疫球蛋白(2500 kDa)则保留在膜的另
20、一端，避免进行肝细胞灌流。2.1.4 肝细胞与非实质细胞的共同培养 对于人体的很多器官和系统来说，细胞和细胞之间的相互作用都是非常重要的。实质细胞和非实质细胞的相互作用，决定了细胞的增长、迁移和分化。这一点在生理学、细胞生物学和发育生物学方面都非常重要，可以据此制定新的方法来治疗疾病。不同细胞间的相互作用在肝脏功能的形成中起到重要作用。肝脏是由复杂的多细胞结构组成的，由内皮细胞分隔成 Disse 小体。肝脏结构还包含脂肪细胞(星状细胞或 Ito 细胞)，胆管细胞和枯否 细胞。因此,成熟的肝脏就是一个很多复杂的细胞相互作用的载体，让各种细胞有效和协调的进行各种功能。研究发现，肝细胞与其它多种细胞共同进行培养，可以在体外稳定存活几个星期并保持其功能活性。共同培养的结果可以广泛应用于各种研究，
