1、中国主要东方蜜蜂种群的遗传多样性分析任 勤 1，曹联飞 2，赵红霞 3,，王瑞生 1，程 尚 1，罗文华 1,曹 兰 1，姬聪慧* 1（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.浙江省农业科学院，浙江 杭州 310021；3. 广东省生物资源应用研究所，广东 广州 510260）摘 要： 对中国具代表性的东方蜜蜂遗传资源中 7个种群的线粒体 DNA tRNAleu CO 基因进行扩增和测序,并进行遗传多样性比较及亲缘关系分析。结果表明，共发现 43个单倍型，其中 10个单倍型在 GenBank数据库对比确认属于新发现单倍型；7 个群体中，阿坝中蜂、滇南中蜂和海南中蜂遗传多样性水平较高，长白
2、山中蜂遗传多样性水平较低，其他群体遗传多样性居中；不同种群间遗传距离变化较大，其中海南中蜂与滇南中蜂、阿坝中蜂间的遗传距离最大，长白山中蜂与云贵中蜂、北方中蜂、华南中蜂间的遗传距离最小；聚类分析显示 7个种群可聚为 4个类群。关键词：东方蜜蜂；遗传多样性；线粒体 DNA中图分类号： 文献标志码：AAnalysis of genetic diversity of Apis cerana populations in ChinaREN Qin1, CAO Lianfei2,ZHAO Hongxia3,WANG Ruisheng1,CHENG Shang1, LUO Wenhua1,CAO Lan1
3、, JI Conghui*1（1.Chong Qing Academy of Animal Science，Chongqing 402460，China；2.Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Zhejiang 310021，China; 3.Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangdong 510260, China）Abstract: The mitochondrial DNA tRNAleu CO II genes in 7 populations of Apis
4、cerana Fabricius in China were amplified and sequenced, and their genetic diversity and phylogenetic relationships were analyzed. The results showed that a total of 43 haplotypes were identified, of which 10 haplotypes were identified new haplotypes in the GenBank database, Among 7 populations, Aba
5、bee, Hainan bee and Yunnan bee have higher level of genetic diversity, Changbai Mountain bee has lower level of genetic diversity, other populationswere intermediate; The genetic distances between different populations varied greatly, of which Hainan bee andhave maximum genetic distance with Yunnan
6、bee and Aba bee, The genetic distances between Changbai mountain bee and Yunnan bee, Middle China bee, Northern bee and Southern bee were small.; Cluster analysis showed that the 7 populations could be clustered into 4 taxa.Key words: Apis cerana Fabricius; genetic diversity; mitochondrial DNA收稿日期：基
7、金项目: 国家蜂产业技术体系基金项目（CARS-45SYZ15）;重庆市畜牧科学院基金项目(16421).作者简介：任勤(1979-), 男, 宁夏固原人，助理研究员, 硕士研究生，主要从事蜜蜂方面的研究。通信作者：姬聪慧(1980-)，女，河南平顶山人，助理研究员，硕士研究生。中国东方蜜蜂资源丰富，分布于除新疆和内蒙古北部以外的广大地区 1。中国的东方蜜蜂资源可分为 5个亚种,分别为中华亚种、西藏亚种、印度亚种、阿坝亚种和海南亚种 2-3。由于地理隔离等因素影响，中国东方蜜蜂在形态及遗传上存在差异，形成了不同的生态型和丰富的遗传资源，有北方中蜂、华南中蜂、华中中蜂、云贵高原中蜂、长白山中蜂、
8、海南中蜂、滇南中蜂、阿坝中蜂和西藏中蜂 4。近年来，国内多位学者采用 mtDNA、微卫星等分子标记对中国华东地区、江苏省、四川省、海南岛、贵州省、重庆市等地东方蜜蜂进行了遗传多样性分析，发现不同地区的中蜂存在较明显的分化 5-12。因此，分析更大范围的东方蜜蜂样本，对于了解其遗传分化水平具有重要意义 14。本研究使用线粒体 DNA tRNAleu CO 基因,对中国具有代表性的遗传资源北方中蜂、华南中蜂、海南中蜂等 7个种群进行遗传多样性对比及群体间亲缘关系分析，为中国东方蜜蜂资源的遗传分化提供信息，从而促进中国东方蜜蜂资源的保护与利用。 1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品采集在中国主
9、要东方蜜蜂分布区的 12个采样地点采集东方蜜蜂样本 300个（见表 1） ，尽可能采集当地较原始饲养蜂群。每群采集工蜂 100只左右，用无水乙醇浸泡，置于冰箱中冷冻保存备用。表 1 蜜蜂样本分布情况及数量Table 1 Distribution and quantity of honeybee samples采样地点sampling position地理型topomorph样本数sample number宁夏固原 Guyuan,Ningxia 北方中蜂 Beifang 20陕西延安 Yanan,Shanxi 北方中蜂 Beifang 20山西太原 Taiyuan,Shanxi 北方中蜂 Bei
10、fang 20广东从化 Conghua,Guangdong 华南中蜂 Huanan 20广西南宁 Nanning,Guangxi 华南中蜂 Huanan 20福建福州 Fuzhou,Fujian 华南中蜂 Huanan 20云南西双版纳Xishuangbanna,Yunnan滇南中蜂 Diannan 30海南海口 Haikou,Hainan 海南中蜂 Hainan 30贵州贵阳 Guiyang,Guizhou 云贵高原中蜂 Yungui 30辽宁绥中 Suizhong,Liaoning 长白山中蜂 Changbaishan 30吉林长白山 Changbaishan,Jilin 长白山中蜂 Ch
11、angbaishan 30四川马尔康 Maerkang,Sichuan 阿坝中蜂 Aba 301.1.2 主要仪器全称、型号及生产厂紫外可见分光光度计（KU-T6/KU-T6PC，南京肯凡电子科技有限公司） 、常规 PCR仪（Eppendorf Mastercycler nexus ，艾本德中国有限公司） 、迷你型水平电泳系统（GCMGU-102T，上海苑胜仪器设备有限公司） 、台式高速冷冻离心机（TG16-WS，长沙湘锐离心机有限公司） 、全自动免染凝胶成像分析系统（GelDoc EZ，济南舜腾生物技术有限公司） 、基因测序仪（NextSeq 550AR，安诺优达基因科技） 。1.1.3 主
12、要试剂细胞/组织基因组 DNA提取试剂盒和蛋白酶 K（北京百泰克生物技术有限公司） 、dNTP、10Buffer、TaqDNA 聚合酶和 Marker（大连宝生物公司） 、DNA 凝胶回收试剂盒（爱思进生物技术有限公司） 、引物（E2 5- GGCAG AATAAGTGCATTG-3 ，H2 5- CAATATCATTGATGACC-3） （上海生工生物工程有限公司合成） 。1.2 方法1.2.1 基因组 DNA的提取每个蜜蜂样本取 1只工蜂进行试验。取出被无水乙醇浸泡过的蜜蜂个体，在灭菌水中清洗 3次，取蜜蜂胸部置于 1.5 mL的离心管中, 用小剪刀剪碎, 按照细胞/组织基因组DNA提取试
13、剂盒(离心柱型)说明书提取基因组 DNA。基因组 DNA用 TE溶解后于-20保存，备用。1.2.2 PCR扩增与测序1.2.2.1反应体系(50 L) 模板 DNA 2 L，10Buffer (含 Mg2+) 5 L，2.5 mmolL-1的 dNTPs 4 L，10 pmol L -1的引物各 2 L，5 U Taq 酶 0.5 L，灭菌双蒸水 34.5 L。1.2.2.2反应条件 95 预变性 4 min；94 变性 1 min, 50 退火 1 min, 72 延伸1 min, 共 35个循环；72 再延伸 10 min。PCR 产物纯化后使用测序仪（型号为 ABI PRISM 373
14、0 l）进行测序。1.2.3 序列分析利用 SeqMan程序对测定获得的序列进行校对，用 MegAlign软件比对所有序列。通过DnaSP 5.0 软件输出单倍型序列，同时计算各样点的单倍型多样度（ Hd） 、平均核苷酸差异数（ K） 、核苷酸多样度（ Pi） 。用 MEGA3.1 软件构建系统进化树。2 结果与分析2.1 PCR扩增及测序结果所有样本均成功进行了扩增和测序，扩增的片段大小约为 450 bp, 与目的片段大小一致，测序获得序列长度约为 400 bp，扩增结果如图 1。1为空白对照，2-21 为部分样品的扩增结果，M 为 250bp Plus DNA Marker1: blank
15、 control; 2-21: Amplification result of some samples; M: 250bp Plus DNA Marker 图 1 PCR产物电泳结果Fig. 1 Electrophoresis results of PCR products 2.2 序列特征分析所有序列比对后, 获得一致序列为 415 bp, 包括 tRNAleu基因部分序列(118 bp)、非编码区完全序列(19108 bp) 和 CO部分序列( 109415 bp)。所有序列中 A+ T含量均在 80%以上，所有序列分析表明，多态性位点有 31个，其中单变异位点 22个，简约信息位点 9
16、个，测序结果如图 2。图 2 测序结果Fig. 2 sequencing result2.3 单倍型分析共检测到单倍型 43个。H2 单倍型是主要单倍型，占总样本数的 46.52%。其余单倍型比例均小于 10%，其中有 16个单倍型的比例大于 1%。43 个单倍型中，10 个单倍型在GenBank数据库中比对确认属于新发现的单倍型，提交的序列号为 MG197799-197808。2.4 群体间遗传多样性比较依据样本分布地，将样品分为海南中蜂（Hainan） 、滇南中蜂（Diannan） 、阿坝中蜂(Aba)、长白山中蜂(Changbaishan)、云贵中蜂(Yungui)、北方中蜂(Beifa
17、ng)和华南中蜂(Huanan)等 7个群体。各个群体的单倍型多样度（ Hd） 、平均核苷酸差异数（ K）和核苷酸多样度（ Pi）见表 2。表 2 群体间遗传多样性比较Table 2 Genetic diversity comparison among populations长白山Changbaishan海南Hainan云贵Yungui滇南Diannan北方Beifang华南Huanan阿坝Aba单倍型多样度Hd0.5083 0.8476 0.6762 0.8857 0.7640 0.6828 0.9048平均核苷酸差异数 K0.558 1.810 0.933 1.905 1.152 0.97
18、6 1.848核苷酸多样度Pi0.00136 0.004400.002250.00460 0.00280 0.002370.00448从表 1可以看出，7 个群体中，阿坝、滇南和海南 3个群体的遗传多样性水平较高，长白山中蜂群体遗传多样性水平较低，其他群体遗传多样性水平居中。2.5 群体间差异比较群体间遗传距离(P-距离法)如表 3 所示。7 个群体间，海南中蜂与滇南中蜂、阿坝中蜂间的遗传距离最大，长白山中蜂与云贵中蜂、北方中蜂、华南中蜂间的遗传距离最小。表 3 群体间遗传距离比较Table 2 Genetic distance among populations长白山Changbaishan
19、海南Hainan云贵Yungui滇南Diannan北方Beifang华南Huanan海南Hainan0.004云贵Yungui0.002 0.005滇南Diannan0.003 0.006 0.004北方Beifang0.002 0.004 0.003 0.004华南Huanan0.002 0.004 0.003 0.004 0.003阿坝Aba0.004 0.006 0.004 0.005 0.004 0.0042.6 系统发育树分析所有单倍型 NJ 法构建的系统发育树如图 3所示。图 3邻接法对单倍型进行聚类分析注：H1-H43 代表 2.3中所检测到的 43个单倍型Fig. 3 NJ m
20、ethod for cluster analyses of haplotypesNote: H1-H43 represents the 43 haplotypes detected in 2.3 图 3显示：存在 4大分支。H24、H25、H28 形成一个分支，属于滇南中蜂；H33、H42形成一个分支，属于华南中蜂；H15、H16、H17、H19、H20、H21 形成一个分支，属于海南中蜂和华南中蜂；其余单倍型形成一个分支。3 讨论3.1 线粒体 DNA 遗传标记可靠性分析线粒体 DNA是真核细胞中核外唯一的遗传物质，绝大多数呈母性遗传 15，且其许多片段呈多态性，在种间及种内具有丰富的遗传多
21、样性 16。蜜蜂属于典型的社会性昆虫，其不同亚种间普遍存在线粒体 DNA多态性。同一蜂群中，所有工蜂具有相同的母系, 作为母系遗传的线粒体 DNA在所有工蜂中都是相同的，任何个体都能代表蜂群的线粒体 DNA遗传方式。使用线粒体 DNA对蜜蜂遗传多样性及亲缘关系进行研究具有简单且不存在群体间变异所产生的差异。3.2 各群体间遗传多样性比较分析对所有样本进行检测，结果显示共检测到单倍型 43个。H2 单倍型是主要单倍型，属于我国东方蜜蜂各群体间普遍存在的单倍型，占总样本数的 46.52%。43 个单倍型中，10个单倍型在 GenBank数据库中比对确认属于新发现的单倍型，分别为H4、H10、H15
22、、H22、H24、H27、H28、H34、H37、H38，说明我国东方蜜蜂遗传资源丰富，不同的群体都具有特殊的遗传背景。群体间单倍型多样度、平均核苷酸差异数和核苷酸多样度分析表明，阿坝、滇南和海南 3个群体的遗传多样性水平较高，单倍型多样度指数最高为 0.9048，平均核苷酸差异数指数最高为 1.905，群体核苷酸多样度指数最高为 0.00448。长白山中蜂群体遗传多样性水平较低，单倍型多样度指数为 0.5083，平均核苷酸差异数指数为 0.558，群体核苷酸多样度指数为 0.00136。其他群体遗传多样性居中。根据以上各指数可以得出，由于地理环境的差异，不同生态、地理种群间遗传差异及多样性程
23、度分化明显。3.3 各群体间亲缘关系分析7个种群的东方蜜蜂可分为 4大类群。其中。滇南中蜂聚为一类，华南中蜂聚为一类，海南中蜂和华南中蜂部分群体聚为一类，其他群体聚为一类。群体间遗传距离指数显示长白山中蜂与云贵中蜂、北方中蜂、华南中蜂亲缘关系较近。海南中蜂与滇南中蜂、阿坝中蜂间的亲缘关系较远，这可能与长期的地理隔离和特殊的自然环境有关。参考文献：1杨冠煌.中华蜜蜂资源调查J.中国养蜂,1984（3）:4-7.2杨冠煌,许少玉,匡邦郁,等.东方蜜蜂在我国的分布及其亚种分化J.云南农业大学学报,1986, 1 (1):89-92.3 龚一飞,张其康.蜜蜂分类与进化M.福州:福建科学技术出版社,20
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