1、辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程编制说明一、 工作简介（一）任务来源辽宁绒山羊原产于我省辽东南山区，有其适应当地环境的生理特点；绒山羊胚胎移植技术还没有省级标准，尤其是操作技术方面是空白，国家行业标准 NY/T 8262004绵羊胚胎移植技术规程和 NY/T 15712007羊胚胎移植技术规程偏向技术理论，可操作性不强；随着生物科学技术发展胚胎移植所用试剂耗材等也有很多进步。因此，亟待有一套绒山羊胚胎移植技术操作规程来规范当下该技术在辽宁绒山羊的操作与应用。2017 年 3 月，为了促进绒山羊选育工作和胚胎移植技术推广应用，畜牧业标准化技术委员会（辽宁）提出了制订辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程项
2、目申请，我院负责规程起草制订。2017 年 6 月，省质量技术监督局下达了地方标准制修订计划辽宁省质量技术监督局关于下达 2017 年第一批辽宁省地方标准制修订项目计划的通知，计划编号 2017292。（二）协作单位标准编制单位为辽宁省畜牧科学研究院。（三）主要工作过程1.成立了标准起草组织机构- 2 -提出规程编制任务后，按照地方标准管理办法要求，我们成立了由院领导和技术骨干人员组成规程制定项目小组。领导组负责规程制定的方案审定和组织协调；项目小组负责制定实施方案和起草规程等工作，项目组成员集体学习了标准制定相关知识，保证了规程制定工作的顺利实施。2.查阅了相关技术资料，确定了规程框架与主要
3、内容；开展重复试验，撰写规程初稿项目组收集查阅了相关技术资料，包括 NY/T 1571-2007羊胚胎移植技术规程、NY/T 826-2004 绵 羊胚胎移植技术规程、NY/T 1674-2008牛羊胚胎 质量检测技术规 程等，将这些标准中重要指标做为重要参考，梳理出了规程框架结构和主要内容。2017 年 5 月、6 月和 9 月开展了三批次试验，结合 2001 年以来10 多次试验，重复验证重要指标、主要内容和操作过程。10 月项目组根据试验和操作撰写了规程初稿，内容完全按照操作流程展开，文字尽量详细描述，附录了计划表、记录表、胚胎图片等，使规程完全展现操作过程，为相关科技人员提供参考、参照
4、。3.征求意见后修改完成标准送审稿2018 年 5 月6 月，标准主要起草单位辽宁省畜牧科学研究院就辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程（初稿），通过辽宁省畜牧兽医局官方网站()向国内各省区广泛征求科研、教学、养殖生产等方面有关人员意见。提出意见 份共 条，我们全部或部分采纳意见 条，其余不予采纳，并根据采纳意见，- 3 -标准起草工作组对辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程的内容进行修正和补充；2018 年 月 日形成了完整的 辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程标准送审稿。2018 年 月 日，辽宁省质量技术监督局组织专家对辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程标准送审稿进行了审定，专家组一致同意通过审定，并提出具
5、体修改意见。根据会审专家审定意见，标准起草工作组对标准进一步修改，2018 年 月 日形成辽宁绒山羊胚胎移植技术操作规程（报批稿），上报辽宁省质量技术监督局，报请辽宁省质量技术监督局作为推荐性行业标准，尽快颁布实施。（四）主要起草人标准主要起草人：豆兴堂、朱延旭、宋先忱、张兴会、郭 丹、李丰田、杨文凯、王家明、全治国、丁世伟。二、标准编制原则和确定地方标准主要内容（一）编制原则本着科学性、规范性、实用性相结合的原则，参考国内法规、标准和有关文献资料，结合辽宁绒山羊实际，科学地确定标准体系框架与主要内容，并对其内容进行准确、详细、规范性描述。编写格式符合 GB/T1.12009标准化工作 导则第
6、 1 部分：标准的结构和编写的要求。（二）主要内容本标准内容主要包括范围、规范性引用文件、术语和定义、羊只选择与管理、超数排卵与同期发情、胚胎移植、术后观察 7- 4 -部分。1. 范围本规程规定了辽宁绒山羊胚胎移植技术的操作规范。本规程适用于辽宁绒山羊品种的胚胎生产及移植技术操作。2. 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4630 辽宁绒山羊NY/T 826-2004 绵羊胚胎移植技术规程NY/T 1571-2007 羊胚胎移植技术规程NY/T 1
7、674-2008 牛羊胚胎质量检测技术规程NY/T 2893-2016 绒山羊饲养管理技术规范3. 术语和定义本条款对术语，辽宁绒山羊、巴氏玻璃管进行了定义。条款内容为：3.1辽宁绒山羊 Liaoning cashmere goat原产于辽宁省辽东半岛山区，体表长绒毛的山羊。3.2巴氏玻璃管 Pasteurized glass tube是一种两端开口的玻璃管，通常内径约 5 毫米，管的一端拉- 5 -细，内径较小。4. 羊只选择与管理本条款介绍供受体母羊、种公羊选择与饲养管理要点。条款内容为：4.1 羊只选择时间与数量比例胚胎移植前 15 d30 d，选择供体羊、受体羊以及种公羊。供体羊与受体
8、羊的数量比例为 156。4.2 供体羊、受体羊选择与管理供体羊为年龄 25 周岁的经产母羊，且符合辽宁绒山羊GB/T 4630 一级以上标准，系谱清楚准确，健康无病，膘情适中，产羔后 4 个月以上，连续观察到 2 个以上正常发情周期。供体超排处理前 15 d 内不做免疫，单独组群饲养。受体羊为年龄 25 周岁的经产母山羊，健康无病，膘情适中。产 羔 3 个月以上，连续观察到 2 个以上正常发情周期。同期发情处理前 15 d 内不做免疫，单独组群饲养。供体羊与受体羊处理前 15 d30 d，除按照 NY/T 28932016 标准饲养管理要求投喂饲料外，额外补饲胡萝卜 0.5 Kg/天 只，避免
9、应激。4.3 种公羊选择与管理与配种公羊年龄 26 周岁，符合辽宁绒山羊 GB/T 4630 特级以上标准，系谱清楚准确。健康无病，膘情适中，性欲旺盛，上一年度有繁殖记录。- 6 -种公羊配种前 15 d30 d，除按照 NY/T 28932016 标准饲养管理要求投喂饲料外，需额外补饲胡萝卜 1 Kg/天只，鸡蛋 3枚5 枚，适当运动，配种前 1 周2 周开始排精，3 次5 次/周。4.4 试情公羊选择与管理 年龄 25 周岁，性欲旺盛，健康无病，膘情适中。按照NY/T 28932016 标准饲养管理。与供体羊、受体羊 试情时，试情公羊要佩戴试情布或试情板，防止误配。5. 超数排卵与同期发情
10、本条款介绍了供体羊超数排卵与供受体母羊同期发情技术操作，本条款内容为：5.1 试剂耗材供体羊超数排卵与同期发情试剂耗材：促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH) 或促黄体素 释放激素 A3（LHRH-A3）、孕马血清促性腺激素(PMSG)、氯前列烯醇(PG) 、维生素 A+D+E 注射液等；羊用孕酮栓（CIDR ）及放置 枪、75%酒精棉球、0.9%生理盐水、5mL 注射器。受体羊同期发情试剂耗材：PMSG、 PG、LHRH-A3、维生素A+D+E 注射液等；羊用 CIDR 及放置枪、 75%酒精棉球、0.9%生理盐水、 5 mL 注射器。5.2 供体羊处理胚胎移植一般宜在 9 月至 11 月进行
11、。根据超数排卵及同期- 7 -发情技术操作推荐程序（附录 A），放栓 时每只羊肌肉注射维生素 A+D+E 2 mL3 mL。利用放置枪将 CIDR 栓呈水平状态放入羊只生殖道内，操作过程中严格消毒。放置 CIDR 栓当天计为 0天。第 11 d 开始每只羊肌肉注射 FSH 1 mL（1520 mg）/次，共8 次，肌肉注射 PG 0.7 mL1 mL。撤栓后 12h 开始公羊试情，间隔 6h8h；供体羊接受试情公羊爬跨时，判定为发情，种公羊及时配种，首次配种后供体羊静脉注射 LH 50 IU100 IU 或肌肉注射促黄体素释放激素 A3 2025 ug,每天配种 34 次，直至供体羊不接受爬跨
12、为止。记录供体羊发情时间及配种时间。5.3 受体羊处理与供体羊同步实施同期发情。放栓时肌肉注射维生素A+D+E 2 mL3 mL/只。按照同期发情技术程序肌肉注射 PMSG 200 IU 250 IU/只，撤栓。同期发情技术操作推荐程序见附录A。6. 胚胎移植本条款介绍了胚胎移植的准备、供体羊胚胎冲取、拣胚与鉴定分级、胚胎移植，本条款内容为：6.1 准备工作6.1.1 胚胎操作液胚胎操作液用于胚胎冲取、拣胚、鉴定和移植等，一般选用磷酸盐缓冲液（PBS ）。PBS 液可使用市售成品或自行配制，主要成份与配制方法见附录 B。- 8 -6.1.2 手术器械准备可升降式羊用手术车、可移动式手术器械车、
13、无影灯、水浴锅。手 术盘，手术刀柄与刀片，直头及弯头止血钳，直头及弯头手术剪，持针钳，固定钳，剃须刀片，镊子，中号圆针，中号棱针等器械，将上述器械用蒸馏水清洗干净，牛皮纸包装后， 120、30 min 条件下高压灭菌后待用； 术前在 0.1%新洁尔灭液中浸泡 30 min，使用前用灭菌的 0.9%生理盐水冲洗。6.1.3 药品与耗材准备甲硝唑注射液、青链霉素、碘酊（棉球）、75%酒精（棉球）、矿物油、兽用麻醉药 846 合剂、兽用苏醒药盐酸苯恶唑、结晶磺胺、新洁尔灭、0.9%生理 盐水；乳胶手套、手 术 服、口罩、鞋套、手术无菌洞巾、中号丝线、敷料、喷壶、注射器（50 mL、10 mL、5 m
14、L、1 mL）。6.1.4 胚胎操作设备与耗材立体显微镜、腹腔镜、水浴锅、控温加热台、集卵杯、35 mm培养皿、10#冲胚管、巴氏玻璃管、16#套管针、7#输液器皮针、细玻- 塑料管、记号笔、 0.22 um 滤器、微量移液枪(1 mL、200 uL)、枪头（1 mL、200 uL）、酒精灯、75%酒精、 95%酒精、面巾纸、铝饭盒、白钢盘等。巴氏玻璃管等玻璃器具用清水洗净后，依次采用浓硫酸中浸泡 24 h、流水冲洗 30 min、洗涤剂刷洗、流水冲洗 1 h、蒸馏水冲洗 5 次、超纯水冲洗 5 次后，放置于干燥箱中烘干，用牛皮纸包- 9 -装，120 、30min 条件下高压灭菌待用；铝饭
15、盒、白钢盘等依次采用流水、蒸馏水冲洗，枪头（1 mL、200 uL）装盒，用牛皮纸包装，120、30min 条件下高压灭菌待用。6.2 供体羊胚胎冲取6.2.1 场所要求待术羊圈应靠近准备室。准备室是用于手术羊只保定、剃毛、消毒等术前处理的场所。手术室紧挨准备室，胚胎操作室以窗口与手术室相通，用于胚胎捡取、鉴定分级及装移植管等胚胎操作。手术室与胚胎操作室术前紫外线照射消毒 1 h2 h，室温保持在2025。各室间需采取物理措施隔离，术前用 0.2%新洁尔灭消毒液对地面喷洒擦拭消毒。6.2.2 胚胎冲取时间供体羊于计划周期的第 17 d，对 28 细胞期胚胎手术冲取；早期囊胚于第 21 d 冲取
16、。6.2.3 手术准备术前羊只禁食不少于 24 h，可少量 饮水。将羊只仰面保定于手术架上，头下尾上，固定四肢；在乳房延向腹部长约 20 cm 宽约 15 cm 为术区，用弯 头手术剪剪除术区绒毛，剃须刀片将短毛剃净，清洗术区皮肤、晾干。每只羊按 0.01 ml/kg 体重肌肉注射兽用麻醉药 846 合剂，待羊只头部自然下垂时，用固定钳将无菌洞巾四角与皮肤固定，用碘酊（棉球）对皮肤消毒，2 min3 min后 75%酒精（棉球） 对 涂碘酊区皮肤脱碘。注射麻醉药后，注意羊- 10 -只状况，防止口腔异物窒息。手术前用 0.1%溶液浸泡 3 min5 min 洗手消毒，再用灭 菌生理盐水冲洗。6
17、.2.4 手术冲胚6.2.4.1 输卵管冲胚在距乳房约 5cm 的腹中线一侧，避开血管，用手术刀纵向切开皮肤长约 8 cm 10 cm，用手 术柄将皮下脂肪及腹肌分离，直至腹膜，零星出血处用敷料压迫止血，若有血管破裂出血用直头或弯头止血钳止血，敷料清创。轻轻将腹膜做一切口，用剪刀将腹膜剪开长约 5 cm8 cm 左右切口；术员手部消毒后，食指及中指伸入腹腔，将子宫角拉出至创口外，适当牵拉卵巢，观察排卵情况，做好记录。将细玻- 塑料管的玻璃管端从左侧输卵管伞口送入约 3 cm 左右，捏 紧伞口与套管并固定，针另一端准备用集卵杯收集冲胚的操作液。用 7#输液器皮针在宫管结合部往输卵管伞方向 30 度刺入 3cm 左右，确定针位于 输卵管腔内，注射器取10 mL20 mL 胚胎操作液，再与输液器皮针相连，匀速持续推注操作液，观察液体回收情况，如遇阻力时可调整皮针或玻璃管位置；冲胚完成后皮针刺入点若出血需用敷料按压止血，卵巢及输卵管表面点滴少许矿物油后，送入腹腔。右侧胚胎冲取同上。两侧冲取完毕后，腹腔内注入甲硝唑液，关闭创口。创口沿腹部至乳房方向，用中号圆针、丝线连续缝合腹膜肌肉层，避免伤及腹腔内器官；创口撒放适量结晶磺胺粉，用大号棱针、丝线结节缝合皮肤层，缝线间距 1cm 左右；皮肤缝 合完毕后，向其表面喷
