1、本科毕业论文（20 届）大血藤叶腐病的病原鉴定与生物防治所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I目录目录 .I摘要 .II关键词 .IIAbstract .IIKeywords .III0 前言.11 材料与方法.11.1 材料来源.11.1.1 菌种来源.11.1.2 供试生防制剂.11.1.3 培养基.11.1.4 试剂.11.1.5 仪器设备.21.2 实验方法.21.2.1 病症的观察与描述.21.2.2 显微镜检查.21.2.3 病原菌的分离与培养.21.2.4 病原菌的鉴定.21.2.5 生防制剂对病原菌的抑制测定.22 结果与分析.32.
2、1 病症的观察与描述.32.2 病原菌的培养性状及形态.32.3 显微镜的镜检及病原鉴定.42.4 生防制剂预防效果比较.52.5 病害预防分析.63 结论.7参考文献.9致谢.10II大血藤叶腐病的病原鉴定与生物防治摘要:本文通过对大血藤( Sargentodoxa cuneata (Oliv.) Rehd. Et Wils.)病症的观察，采用组织分离法分离得到病原菌，通过对病原菌的菌落的形态特征的观察和孢子的大小的测定，鉴定出引起凯里市大血藤病害的是瓜果腐霉，其病原菌为瓜果腐霉病（ Pythium aphanidermatum） 。本文针对大血藤瓜果腐霉选择生防制剂对其进行生物防治实验，比
3、较它们的抑菌效果。关键词：大血藤；组织分离法；瓜果腐霉菌；生物防治Identification of the pathogen of Pythium aphanidermatum in Sargentodoxa cuneata mildew and disease preventionAbstract: This article through to Sargentodoxa cuneata (Sargentodoxa cuneata (Oliv.) Rehd. Et Wils.) illness observation, using tissue isolation method isola
4、ted pathogen, through the determination of observation and spore morphological characters of the pathogen of the colony size, identified by the primary disease in Kaili city is Pythium aphanidermatum, pathogenic bacteria is fruit rot mildew (Pythium aphanidermatum). In view of Sargentodoxa cuneata P
5、ythium aphanidermatum selection of biocontrol agents for biological control experiments on the, compare their antibacterial effects.Keywords: Sargentgloryvine Stem; tissue isolation method; Pythium aphanidermatum; biological control10 前言大血藤又名血藤、红皮藤、千年健等，为木通科植物大血藤（Sargentodoxa cuneata (Oliv.) Rehd. E
6、t Wils.）的茎。生于山坡疏林、溪边；有栽培。性味苦，平。但近来我们通过实验发现，大血藤当作植物染料对棉、毛的染色效果很好，色牢度均不错，相比接近的鸡血藤而言，大血藤染色的牢度更好。这也为我们开发天然植物染色提供了新的染料品种。大血藤一般作为中药使用，具有败毒消痈，活血通络，祛风杀虫的作用。治急、慢性阑尾炎，风湿痹痛，赤痢，血淋，月经不调，疳积，虫痛，跌扑损伤。但 随 着 大 血 藤 种 植面 积 的 扩 大 ， 各 种 病 虫 害 也 相 继 出 现 。 其 中 瓜 果 腐 霉 病 害 的 主 要 病 害 之 一 。因 此 ， 本 文 对 大 血 藤 进 行 初 步 的 病 害 分 析
7、， 简 要 提 出 对 大 大 血 藤 的 防 治 措 施 ，以 期 为 贵 州 省 黔 东 南 州 大 血 藤 真 菌 病 害 具 有 一 定 的 参 考 价 值 。1 材料与方法1.1 材料来源1.1.1 菌种来源 贵州省黔东南苗族侗族自治州锦屏县启蒙镇边沙村。1.1.2 供试生物试剂枯草芽孢杆菌 F1、F2 、F8 制剂。1.1.3 培养基 PSA 培 养 基 ： 称 取 200 g 马 铃 薯 ， 洗 净 、 去 皮 、 切 碎 ， 加 水 1000 ml煮 沸 30 min， 纱 布 过 滤 ； 在 过 滤 后 的 溶 液 里 加 入 10 20 g 蔗 糖 和 17 20 g 琼
8、脂 ， 充 分 溶 解 后 趁 热 纱 布 过 滤 ； 将 溶 液 分 装 到 试 管 和 三 角 瓶 中 ； 121 灭 菌 20 min， 冷 却 后 备 用 3。1.1.4 试剂 75%乙醇、0.1%升汞、链霉素21.1.5 仪器设备 恒温培养箱、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、光学显微镜、目镜测微尺、冰箱及其他实验仪器。1.2 实验方法1.2.1 病症的观察与描述症状的观察主要是对病害组织的表面病斑形态、病部颜色、病斑的大小等方面进行观察和描述，并对危害组织进行拍照。1.2.2 显微镜检查显微镜检查分为真菌病害标本和病原菌的显微镜检查两个方面，主要是观察菌落特征、菌丝体和其他营养体的结
9、构、孢子的形态和着生方式、子实体的形态结构和产生部位等 4-5。同时，对部分病菌在多媒体教室数码显微镜下拍摄照片，进行记录。1.2.3 病原菌的分离与培养对病原真菌的分离采用组织分离法。取病健交界处的叶片小块组织 2-4mm，先用 70%的酒精对大血藤叶片病斑部进行表面消毒处理，然后放入 0.1%的升汞溶液中进行消毒 2 分钟，再放进无菌水中漂洗 3 次，移入 PSA 平板内培养。在 PSA 培养基上 28培养 34 天，病组织的周围长出不同的菌丝体，挑取外围新长的菌丝，分别移置到新的添加链霉素的 PSA 培养基上，依次重复多次，直至得到纯的病原菌进行纯培养，然后对菌落进行拍照。利用组织分离法
10、对大血藤叶片进行病原菌的分离。1.2.4 病原菌的鉴定对大血藤病原菌的鉴定采用传统的光学显微镜观察法。用灭菌后的移植针挑取少许，放在加有一滴水的载玻片，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。观察菌丝的颜色，是否有隔，是否有分支；观察分生孢子的颜色，形态结构。并挑3取 50 个孢子大小进行测量、记录和拍照。1.2.5 生物试剂对病原菌的抑制测定选取国内外较为常用的生物试剂:F1、F2、F18。为了保证实验的成功，选取 6 个灭菌后的 PSA 培养基，进行菌种的纯培养，用保鲜膜密封，3-5 天后选取生长情况较好的 3 个纯培养菌种，在此培养基内边缘选定呈等边三角形的 3个点，然后分别将 F1、F2、F18
11、 接种在选取的三角形顶点位置，用保鲜膜密封，同时做 3 个此实验进行比较，然后置于 28的恒温箱中倒置培养，2-3 天后观察菌种的生长情况，并拍照进行记录。2 结果与分析2.1 病症的观察与描述大血藤叶腐病发病主要部位是叶片、侧枝。幼嫩枝干上的病斑开始时圆形或椭圆形，初为紫褐色，渐变黑褐色，病部稍下陷，以后互相融合，重病株上的病斑沿主干向下蔓延至叶柄，最后整株死亡；叶片 果实上的病斑圆形，融合后成不规则形，暗褐色至黑色；嫩叶往往皱缩变形 9。病斑大小 1.0-5.0cm0.5-3.0 cm，有明显的病健交界 （如图 1、图 2） ，发病严重时整片叶子都会烂掉然后脱落。图片 1 图片 242.2
12、 病原菌的培养性状及形态在 PSA 培养基上，病原菌生长较快，菌落成辐射状生长，边缘整齐。菌丝白色，后变成灰色。菌落初期为乳白色，成絮状或绒状（图 3、图 4） 。3-4 天后，菌落中央开始出现灰色并逐步变黑，菌落中央出现紫红色油滴。图片 3 菌落正面 图片 4 菌落背面 2.3 显微镜的镜检及病原鉴定菌落在 CMA 上呈放射状，气生菌丝绵絮状。菌丝发达，分枝繁茂，粗 2.8-9.8m。孢子囊为膨大菌丝或瓣状菌丝、不规则菌丝组成，顶生或间生， 63-735m4.9-22.6m，平均 236.9m13.8m；出管长短不一，粗约4.2m；泡囊球形，内含 6-25 个或更多的游动孢子；游动孢子肾形，
13、侧生双鞭毛， 13.7-17.2m12.0-17.2m；休止孢子球形，直径 11.2-12.1m。藏卵器球形，平滑，多顶生，偶有间生，柄较直，直径 17-26（平均 23.7）m，内含贮物球和折光体各一个（图 6、图 7） 。根据病原菌的形态特征及大小，鉴定该病原菌为假菌界卵菌门腐霉目腐霉科腐霉属瓜果腐霉 （ Pythium aphanidermatum） 。5图片 6 瓜果腐霉菌分生孢子（1040） 图片 7 瓜果腐霉菌菌丝（1040） 2.4 药剂预防效果比较及病害预防分析：对大血藤瓜果腐霉菌菌丝生长的抑制作用测定结果表明（图 8 和图 9） ，供试的 3 种药剂对治病的瓜果腐霉菌都具有抑
14、制作用。其中，F1 的抑制作用最强，抑制效果为 100%，其次是 F18，抑制效果为 100%,最后是 F2，抑制效果也比较好，只是没有 F1、F18 明显。图片 8 瓜果腐霉菌生防效果图（正面） 图片 9 瓜果腐霉菌生防效果图（背面）3 结论大血藤为落叶木质藤本，一般作为中药使用，如治疗急性阑尾炎、治疗胆道蛔虫病、治疗瘤型麻风结节反应、治疗瘤型麻风结节反应、治疗灼伤等；实验还发现，大血藤当作植物染料对棉、毛的染色效果很好，色牢度均不错，相6比接近的鸡血藤而言，大血藤染色的牢度更好。这也为我们开发天然植物染色提供了新的染料品种。 但由于近年来环境的恶化，使得大血藤各种病症层出不穷。大量研究表明
15、，瓜果腐霉属于卵菌门卵菌,引起多种植物猝倒病和瓜果腐烂病在高温、高湿条件下对禾本科坪草有较强的致病性,可造成坪草的大面积病害甚至死亡。瓜果腐霉病是藤本植物上一种很普遍的病害，通常出现在初级和夏季，主要危害木本植物地上部分的叶片和果实，引起早期落叶、落果。瓜果腐霉病是一类多变性的真菌，其分布广泛，寄主繁多，是植物病害中重要病原菌之一 11。而贵州凯里地区的光照条件较差，降雨日数较多，阴雨连绵，相对湿度较大 12，更有利于瓜果腐霉病的发作，直接影响大血藤的药用效果而且降低经济效益。目前，国内外对大血藤的药用化学成分的类别、结构和药理以及其分子生物学、 生态学方面有一定的研究，但是，对大血藤的病害却
16、没有相关的研究报道。大血藤的研究仍处在人工驯化的初期阶段，有关大血藤胶孢炭疽菌病害的相关报道及研究几乎没有。所以对大血藤的病害研究有一定的价值。目前人们在瓜果腐霉病的防治方面主要采取生物防治：而本文从生物防治的角度提供一个新的视野。采用组织分离法分离得到大血藤瓜果腐霉病原菌，通过对病原菌的培养性状、分生孢子的形态观察及大小测定，证明该病原菌为假菌界卵菌门腐霉目腐霉科腐霉属瓜果腐霉 （ Pythium aphanidermatum） 。实验中选用 F1、F2、F18，这种生物试剂对于大血藤瓜果腐霉病菌的抑制率达到100%以上，对抑制病菌生长有着特效作用，说明 F1、F2可以作为病害防治的重要研究
17、材料。该生物试剂具有低毒、易降解，作用方式和机理较复杂，病菌不易产生抗药性。所以发展生物试剂是社会、市场、公众的需要，是社会进步和自然科学发展的必然趋势。该类生物试剂具有生物降解快，毒性低，不易产生抗性等优点而被人们寄予厚望，已成为农药研究的热点 20。7参考文献 1 林圣玉.香樟在园林绿化中的应用与分析J.中国林业，2010,11B:49.2 张雷.樟 的 特 征 特 性 及 其 栽 培 技 术 J. 现 代 农 业 科 技 ,2001,08:222-224.3 方中达.植病研究方法M. 北京：农业出版社，19794 许文耀.普通植物病理学实验指导M.北京:科学出版社,2006:69-73.
18、5技大学学报:自然科学版,2001,29(2):65-68贵州气候. http:/ 史卫国,徐之明,黄清臻,等.植物源农药的进展J.农药科学与管理,1997,(3):33-35.7 应 俊 生 ,张 玉 龙 .中 国 种 子 植 物 特 有 属 M. 北 京 :科 学 出 版 社 ,1994:36-539.8 倪 士 峰 ,傅 承 新 ,吴 平 .大 血 藤 化 学 成 分 及 药 学 研 究 进 展 J.中 国 野 生 植物 资 源 ,2004,23(4):8-10.9 李 钧 敏 ,陈 永 辉 ,金 则 新 ,等 . 大 血 藤 黄 酮 类 化 合 物 的 提 取 与 分 析 J.武汉 植
19、 物 学 研 究 ,2002,20(2):157-161.10 尹 泉 ,李 惠 芬 ,周 群 ,等 .大 血 藤 药 材 及 不 同 提 取 物 FTIR 的 比 对 分 析 J.光 谱 学 与 光 谱 分 析 ,2010,30(1):54-57.11田 瑛 ,张 慧 娟 ,屠 爱 萍 ,等 .中 药 大 血 藤 的 酚 性 化 合 物 J.药 学 学 报 ,2005,40(7):628-631.12 邵 红 ,李 钧 敏 ,金 则 新 .不 同 产 地 大 血 藤 次 生 代 谢 产 物 含 量 比 较 J.植 物研 究 ,2006,26(3):342-348.13 李 钧 敏 ,金 则
20、新 ,邵 红 .大 血 藤 叶 片 提 取 物 的 抑 菌 活 性 分 析 J.中 药 材 ,2005,28(10):906-908.14 张 宏 意 ,廖 文 波 ,陈 月 琴 ,等 .大 血 藤 的 rDNA ITS 序 列 分 析 J.广 西 植 物 ,2008,28(6):737-740.15 Kawago E, Suzu K. Self-pollen on a stigma interferes without-crossed seed production in a self-incompatile monoecious plant,Akebia quinata (Lardizab
21、alaceae) J. Functional Ecology,2005(19):49-54.16 李 钧 敏 ,金 则 新 ,钟 章 成 .不 同 海 拔 高 度 大 血 藤 群 体 遗 传 多 样 性 的 RAPD分 析 及 其 与 环 境 因 子 的 相 关 性 J.生 态 学 报 ,2004,24(3):567-573.17 王 孜 昌 ,王 宏 艳 .贵 州 省 气 候 特 点 与 植 被 分 布 规 律 简 介 J.贵 州 林 业 科技 ,2002,30(4):46-49.18 赖 传 雅 .农 业 植 物 病 理 学 （ 华 南 本 ） M.北 京 :科 学 出 版 社 ,2003
22、.19 柳 吉 春 .苹 果 几 种 真 菌 性 病 害 防 治 技 术 J.河 北 果 树 ,2009(1):13.20 李 怀 方 ,刘 凤 权 ,黄 丽 丽 ,等 .园 艺 植 物 病 理 学 M.北 京 :中 国 农 业 大 学 出版 社 ,2009(6):169-17121 张 国 辉 ， 张 文 华 ， 刘 冬 莲 . 八 月 瓜 炭 疽 病 的 病 原 菌 鉴 定 及 病 害 分 析 J.中国 农 学 通 报 ， 2011,27(13):277-288.22 冯 俊 涛 ,石 勇 强 ,张 兴 .56 种 植 物 抑 菌 活 性 筛 选 试 验 J.西 北 农 林 科 技大 学 学 报 :自 然 科 学 版 ,2001,29(2):65-68.23 史 卫 国 ,徐 之 明 ,黄 清 臻 ,等 .植 物 源 农 药 的 进 展 J.农 药 科 学 与 管 理 ,1997,(3):33-35.
