1、本科毕业论文（20 届）鸡屎藤离体快繁培养基的筛选所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I目 录目 录 .I摘要 .II关键词 .IIAbstract.IIKey words.II1 前言 .12 材料与方法 .22.1 试验材料 .22.2 试验方法 .22.2.1 培养基的配置 .22.2.2 灭菌 .22.2.3 开启无菌操作台中的紫外灭菌灯 .22.2.4 准备试验材料 .32.2.5 接种 .32.2.6 初代培养 .32.2.7 继代培养 .33 结果与分析 .93.1 MS 培养基，B5 培养基， N6 培养基上诱导的愈伤组织 .93.2
2、 初代培养试验结果与分析 .93.3 MS 培养基，B5 培养基上继代的培养物 .104 结论 .10参考文献 .10致谢 .12II鸡屎藤离体快繁培养基的筛选摘要：【目的】找出适合鸡屎藤离体快繁的最佳培养基。 【方法】以鸡屎藤的叶作为试验材料，采用 MS 培养基、B 培养基、N 6 培养基对其进行组织培养，观察并记录愈伤组织的分化状况，计算诱导率。 【结果】MS 培养基最适合鸡屎藤离体快繁， 培养基其次， 培养基效果最不明显。关键词：鸡屎藤；离体快繁；诱导率Paederia scandens in vitro rapid propagation medium selectionAbstrac
3、t: Objective to found out the suitable Paederia scandens in vitro Rapid Propagation of optimal culture medium, method the Paederia scandens leaves as test material, using MS medium, B5 medium, N6 medium for tissue culture, observe and record the differentiation of callus induction rate conditions, c
4、alculation of. results MS culture medium for micropropagation of Paederia scandens, B5 medium secondly, N6 medium effect was the most obvious.Key words: Paederia scandens; micropropagation; induction rate11 前言鸡屎藤(Paederia scandens)系茜草科鸡屎藤属多年生蔓性草质藤本植物，别名鸡矢藤，牛皮冻 1。主要分布于我国长江流域及其南部地区。常生长在气候湿热的灌木丛和荒坡郊野。鸡
5、屎藤既可入药，有消食祛风湿、活血消肿功效 2，其嫩茎叶又是广东、海南一带居民喜欢吃的美味野菜。据分析，它的叶子含有多种成分挥发油 3。由于鸡屎藤的叶被揉烂后常常发出一股鸡屎的臭味，因此而得名。鸡屎藤的抗坏血酸含量很高，远高于一般的水果及蔬菜，矿质元素含量也很丰富，氨基酸的种类搭配齐全、合理，是一种聚营养、药用功能于一体的珍贵野菜资源之一。鸡屎藤全株都可以入药，因为它含有鸡屎藤苷（paederoside）及车叶草苷（ asperulosede）等多种成分。其味甘酸、性平。在我国，鸡屎藤植物资源丰富，在山东、江苏、福建、广东、湖北、四川、贵州、云南等省都有分布。在外国，印度、马来西亚、日本等也有分
6、布。鸡屎藤作为传统的中草药，除了具有消食祛风湿、活血消肿的作用之外，还具有清热、解毒、补血和治疗腹泻痢疾、外伤性疼痛、黄疸型肝炎、肠炎、肺结核咯血、支气管炎等功效，现如今常用它的根、茎、叶、果实的提取物来治疗类风湿性关节炎、牙痛、胸痛，也可用来作为催吐药和利尿剂。现代药理学研究还证明，鸡屎藤具有镇痛、镇静的作用，对痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌有抑制作用，尚有治疗多发性骨髓瘤、肝癌的作用。此外，鸡屎藤茎上的皮还是造纸及人造棉的重要原料。正是基于鸡屎藤有着如此宝贵的药用和食用价值，且自然条件下贵州省 1年只能收 1 季，并且绝大多数是野生的，人工种植面积很小，导致产量非常有限，难以满足市场
7、的需求，加上经过文献检索发现国内外对鸡屎藤离体快繁的报道极少，尚未发现有人对鸡屎藤的离体快繁培养基筛选有相关研究，这充分肯定了拟写该篇论文的意义。为了更进一步地开发鸡屎藤，使鸡屎藤一年四季能被人类大规模地种植和利用，给人类带来福音，更为了深入开发利用贵州省中草药资源和大力推动地方经济的发展，拟写该篇论文。利用组织培养技术快速繁殖鸡屎藤，对鸡屎藤的开发利用和野生资源保护具有重要的现实意义，我特将对鸡屎藤的离体快繁几种培养基筛选结果报道如下：232 材料与方法2.1 试验材料生长健壮、幼嫩、无病虫害的鸡屎藤叶。本试验所用鸡屎藤的叶采自贵州省凯里市经济开发区凯里学院生物实验楼后山八月瓜种植基地附近，
8、2012 年 7月、8 月、9 月各采集一次，现采现用。2.2 试验方法2.2.1 培养基的配置按照表 1 中的配方分别配制 MS 培养基、B 培养基、 N6 培养基各 1 升（除了表 1 中的配方外，还需加入 NAA0.5mg/L 、6-BA0.5mg/L、琼脂 8g/L）即MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+琼脂 8g/L，B +NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+琼脂 8g/L，N 6+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+琼脂 8g/L。配制过程中，要选用新鲜的蒸馏水。由于需要称量的药品较多，而且有些药品称量的量极少，为了减少麻烦，使接下来的试验过程更
9、加方便快捷，可以把各种培养基的药品的量扩大 10 倍、100 倍再称量，分别配制 3 种培养基的母液（各种母液中都事先不要加入 CaCl22H2O 和激素，因为加入 CaCl22H2O 后易产生沉淀，配制培养基时再加。除此之外，需加热溶解的药品一定要水浴加热溶解，如FeSO47H2O、CaCl 22H2O。配好的母液必须清澈透明才能使用）当需要配制培养基时，取用适量的母液按已扩大的倍数稀释即可。2.2.2 灭菌将配制好的培养基分装到培养瓶中（30mL/瓶） ，每 1 种培养基得到 33 瓶。准备 1000mL 大烧杯 2 个，500mL 大烧杯 3 个，大培养皿 2 个，玻璃棒 1 根，枪形镊
10、 2 把，解剖刀 1 把，滤纸 15 张，1000mL 用广口瓶装好的蒸馏水，分别用报纸和橡皮筋包扎好后，整齐规范地放入高压蒸汽灭菌锅中，121 oC、1.01Pa灭菌 30min。2.2.3 开启无菌操作台中的紫外灭菌灯在培养基灭菌的时候，用 75%的酒精四处喷洒无菌操作台的台面并用酒精棉球擦拭 1 遍，之后将装有 75%酒精棉球的试剂瓶 1 个，装有 75%酒精的试剂瓶 1 个，装有 0.1%升汞的试剂瓶 1 个，酒精灯 1 盏，打火机 1 个，放入操作台，把操作台的门关上，打开紫外灯，并把风速调到最大，灭菌 20min。42.2.4 准备试验材料将采集来的鸡屎藤嫩叶用洗洁精轻轻的清洗 1
11、 遍，用大量自来水冲洗数遍，沥干水备用。2.2.5 接种穿上无菌服，用酒精喷洒双手后将已灭好菌的培养基等物品在关闭紫外灯的情况下放入无菌操作台，再打开紫外灯接着灭菌 10min，之后关掉紫外灯，风机依然开到最大，等培养基和无菌水冷却后开始接种。用 75%酒精喷洒完双手后把已经洗净沥干水的鸡屎藤叶放入操作台上的烧杯中，用 75%的酒精消毒1030s，之后用无菌水冲洗 5 次后，用 0.1%的升汞溶液消毒 10min，之后用无菌水冲洗 8 次，沥干水后放入垫有无菌滤纸的培养皿中，在酒精灯旁把鸡屎藤叶切成 1mm2 大小的方块，用枪形镊接种到培养瓶中，每瓶接种 4 片，每接种1 次，枪形镊在酒精灯上
12、灼烧 1 次，接种要注意在酒精灯旁操作，且要将瓶盖在酒精灯上绕 2 圈以便最大程度地灭菌。3 种培养基上分别接种了 120 片鸡屎藤外植体。2.2.6 初代培养把已经接种好外植体的培养瓶放入恒温箱中培养，第 1 周不需要光照，第2 周开始白/夜光照 12h，光照强度 80xl，温度都为 25oC。观察并记录结果。以上试验重复 3 次，取平均值。MS 培养基诱导的愈伤组织数为 86 片，B 5 培养基诱导的愈伤组织数为 72 片，N 6 培养基诱导的愈伤组织数为 2 片，见表 2。由此舍弃 N6 培养基的继代。2.2.7 继代培养当外植体长出愈伤组织，即接种 3 周左右后，原本的培养基营养已经差
13、不多消耗完了，此时进行继代培养。继代培养的培养基配方与初代培养的相同。诱导出的愈伤组织有大有小，所以在继代的时候需按照它的大小来切割。MS培养基上的 86 片愈伤组织有 20 片切成 6 块，23 片切成 5 块，29 片切成 4 块，14 片切成 3 块，20 片切成 2 块，每瓶继代 4 块，共继代了 108 瓶。B 5 培养基上诱导的 72 片愈伤组织，18 片切成 6 块，12 片切成 5 块，17 片切成 4 块，23片切成 3 块，2 片切成 2 块，每瓶继代 4 块，共继代了 77 瓶。只要未被污染的5培养物都长势良好，见表 3。表 1 MS 培养基、B 培养基、N 6 培养基配
14、方用量（mg/L ）成分MS B5 N6大量元素NH4NO3 1650KNO3 1900 2500 2830CaCl22H2O 440 150 166MgSO47H2O 370 250 185KH2PO4 170 400(NH4)2SO4 134 463 NaH2PO4H2O 150微量元素KI 0.83 0.75 0.8H3BO3 6.2 3.0 1.6MnSO4H2O 16.9 10 3.3ZnSO47H2O 8.6 2.0 1.5Na2MoO42H2O 0.25 0.25CuSO45H2O 0.025 0.025CoCl26H2O 0.025 0.025Na2EDTA2H2O 37.3
15、37.3 37.3FeSO47H2O 27.8 27.8 27.8有机成分甘氨酸 2.0 2.0盐酸硫胺素 0.4 10 1.0盐酸吡哆醇 0.5 1 0.5烟酸 0.5 1 0.5肌醇 100 100蔗糖 30g 20g 50gPH 5.7 5.5 5.8672.3 试验观察及数据统计表 2 初代培养观察记录表初 代 培 养 观 察 记 录0123456789第 3天 第 4天 第 5天 第 6天 第 7天 第 8天 第 9天 第 10天 第 11天 第 12天 第 13天 第 14天 第 15天 第 16天 第 17天 第 18天 第 19天 第 20天观 察 天 数 /d污 染 瓶 数
16、（ 诱 导 片 数 ）污 染 数 （ 瓶 ） MS 污 染 数 （ 瓶 ） B5 污 染 数 （ 瓶 ） N6 诱 导 数 （ 片 ） MS 诱 导 数 （ 片 ） B5 诱 导 数 （ 片 ） N6图 1 初代培养情况统计图污染数（瓶） 诱导数（片）观察天数（d） MS B5 N6 MS B5 N6第 3 天 0 0 1 0 0 0第 4 天 0 0 0 0 0 0第 5 天 1 1 1 0 0 0第 6 天 1 1 0 0 0 0第 7 天 0 2 1 0 0 0第 8 天 1 0 0 3 0 0第 9 天 0 0 1 4 2 1第 10 天 1 0 1 7 5 0第 11 天 1 1 0 5 3 0第 12 天 0 1 0 6 2 0第 13 天 1 0 1 7 4 0第 14 天 0 0 1 5 6 0第 15 天 0 1 0 8 3 1第 16 天 0 1 1 6 6 0第 17 天 1 0 0 8 6 0第 18 天 0 0 1 4 5 0第 19 天 0 0 0 8 4 0第 20 天 0 0 0 6 8 0
