精选优质文档-倾情为你奉上PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在1530碱基之间。引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%60%之间,Tm值最好接近72。GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值510。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为5580,其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。4.引物3端要避开密码子的第3