1、 毕业论文 开题报告 生物 工程 PCR及等温环介导扩增技术在哈维氏弧菌上的应用 1 课题研究意义及国内外研究现状 课题研究意义： 自上世纪八十年代以来，我国海水养殖业发展迅速，走过了藻、虾、贝、鱼的开发历程，形成了“四次浪潮”，使我国一跃而成为世界上第一个养殖产量超过捕捞产量的国家。然而，随着工厂化高密度养殖的发展，各种病害相继发生。 其中，弧菌性病害是最重要的病害之一，已成为海水养殖业持续发展的一大障碍。动物，如虾类、贝类和鱼类等。哈维氏弧菌病曾在我国养殖的中国对虾、南美白对虾、长毛对虾及日本 对虾中大规模暴发。哈维氏弧菌也是多种鱼类的重要病原菌，其中包括在我国具有重要经济价值的海水养殖鱼
2、类，如牙鲆、大菱鲆、鲈鱼、大黄鱼、黑鲷、青石斑鱼、斜带石斑鱼、舌鳎等。哈维氏弧菌不仅宿主范围广，而且其弧菌病的暴发给海水养殖业造成了巨大的经济损失。因此，对哈维氏弧菌进行深入的研究，对于我国水产养殖业的健康发展具有重要的战略意义。 哈维氏弧菌是水产养殖动物的重要致病菌，能够感染多种无脊椎动物和脊椎对于哈维氏弧菌病的防治，目前使用的仍是以抗生素为代表的化学疗法。抗生素类药物的应用，破坏了养殖环境中土著细菌的多样性， 导致抗药性病原菌增加。抗生素的使用还引起药物残留，对食用者造成危害。寻找对环境友好的防治哈维氏弧菌病害的方法，是我国水产养殖业可持续发展的迫切要求。在可预见的未来，哈维氏弧菌病害防治
3、的主要思路有两条：一是提高水产养殖动物本身的抗病能力，包括发展免疫防治技术及培育抗病鱼种；二是研制对环境无害的绿色生物渔药。显然，这两种思路都离不开对哈维氏弧菌致病机理的深入理解。因此，对哈维氏弧菌致病因子的作用机理进行深入研究，具有十分重要的理论和实践意义。 国内外研究现状： 哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性、发光的 (并非所有菌株 )需盐海洋细菌，菌体呈弧状，极生单鞭毛。哈维氏弧菌首次被 Johnson和 Shunk(1936)描述为哈维氏无色杆菌，主要是为了纪念 E N Harvey在发光现象的系统研究方面所做出的突出贡献。多年以来，它也曾被命名为哈维氏发光杆菌和哈维氏贝内克氏菌。随后， Ba
4、umann等于 l 980年将其命名为哈维氏弧菌，并沿用至今。哈维氏弧菌广泛分布于近岸温暖的海洋环境，如海水、海洋沉积物、海洋动物的体表、海洋发光鱼类和头足类动物等各种海洋场所，也是许多海洋脊椎动物和无脊椎动物的正常菌群。 哈维氏弧菌是发光性弧菌病 的主要病原，能够感染多种海洋脊椎动物和无脊椎动物。在泰国、印度、澳大利亚、厄瓜多尔、委内瑞拉及中国 (包括台湾 )等国家和地区，哈维氏弧菌曾被报道是养殖对虾的主要病原菌。在这些国家和地区，发光性弧菌病是养殖对虾最主要的病害。这种疾病名称是由哈维氏弧菌呈高密度生长时的发光现象而得名，它主要感染苗期动物及动物的幼体，症状表现为动物体变得不透明、运动性减
5、弱、发光和死亡等。哈维氏弧菌同时也是鱼类的病原菌，发病的症状和病理随着患病鱼的种类及身体状况不同而有所差别，但其典型症状为角膜不透明和眼球突出。已报道的患病鱼种主要有 鲈鱼、养殖黑棘鬣鱼、棕色斑点石斑鱼、遮目鱼、大西洋棘白鲳、银色鲻鱼和短翻车鱼等。 目前，哈维氏弧菌的基因序列检测主要除了传统的 PCR 检测技术外，还有更加严谨简便的等温环介导扩增技术（ Lamp）快速检测。 2 课题研究的主要内容、预期目标和研究方案 主要内容： 本研究先用传统的 PCR技术快速检测获得测出的 ToxR基因序列，再将环介导等温扩增技术应用于哈维氏 弧菌的快速检测，建立了一种针对 哈维氏 弧菌中的 ToxR基因
6、(t h)的 LAMP检测方法，并将两种方法进行比较分析。 预期目标：（ 1） .制备培养基，选取 获得单克隆菌株后活化培养； （ 2） .用试剂盒提取菌的 DNA 进行 PCR 电泳，并获得 ToxR 基因序列； （ 3） .根据序列设计目标引物，进行 Lamp 快速检测； （ 4） .整理数据，完成毕业论文。 研究方案： 对克隆的哈维氏弧菌的全长 toxR基因及进行相关的序列分析。根据查得的几种弧菌 toxR基因两翼核苷酸序列，设计和合成上下游简并引物，以哈维氏弧菌 菌 株的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增，将获得一定的扩增片断进行克隆、鉴定和测序。首次获得哈维氏弧菌约 400bpto
7、xR基因全长核苷酸序列。与其它弧菌的相应序列分析比对显示，该序列与霍乱弧菌的 toxR基因有极大的相似性，与鳗弧菌的 toxR基因也有较高的相似性，与副溶血弧菌的 toxR基因的相似性一般。 toxR基因全长核苷酸序列的获得将为拟态弧菌的菌种鉴定增添新的分子靶标，有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受 toxR基因调控的致病基因。 1）病原菌株、质粒和表达菌株 2）分子生物学试剂，哈维氏弧菌总 DNA的提取 3） PCR反应体系和程序单次和同步 PCR反应产物的检测 4）重组蛋白的表达和纯化，并得 到序列 LAMP技术依赖于能够识别靶 DNA上 6个特定区域的 4条特异性引物 (包
8、括两条内引物和两条外引物 )和一种具有链置换活性的 DNA聚合酶扩增靶 DNA，在扩增反应的起始阶段 4条引物共同作用，识别靶DNA，而在扩增循环及延伸阶段仅两条内引物起作用，因此，与 PCR等方法相比， LAMP的引物设计很巧妙，是成功实现 LAMP扩增的关键。 本课题中，针对 哈维氏 弧菌砌基因设计了几套 LAMP引物，分别对哈维氏弧菌标准菌株进行 LAMP扩增。使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，发现仅使用第三套引物 LAMP3进行扩增反 应时，在哈维氏弧菌泳道呈现出 LAMP特有的阶梯状条带，表明扩增反应生成了由多重复靶序列的茎环状 DNA和花椰菜状 DNA所组成的混合物，扩增反应成功进行
9、；另外，肉眼观察其阳性反应管，发现该反应体系变混浊，并且短时间离心之后，反应管底部出现白色沉淀，这是因为 LAMP扩增效率很高，反应中核酸大量合成，从 dNTPs析出的焦磷酸根离子与体系中的镁离子结合，产生的扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀，使得反应体系浊度发生变化，肉眼可见。 3 课题进度计划 2010.07 2010.08：查找资料，确定实验方法 2010.08 2010.09：完成开题报告，准备实验材料 2010.10 2010.10： 选取适合菌株进行活化培养，为下一步做准备 2010.11 2010.12： PCR 技术测序，得到报告后设计引物，再开始 Lamp 实验 2011.01 20
10、11.03：整理与分析数据，完成毕业论文 4 参考文献 1 COPLAND J W， GREY D L Management of wild and cultured sea bass barramundi(Lates calcarifer Bloch)A Proceeding of an International Workshop Help at Darw in N T，AustraliaC ACIAR Proceedings， 1987 20 2 AOKI T， EGUSA S Drug sensitivity of Aeromonas liquefaciens isolated fro
11、m freshwater fishesJ Bull Japan Soc Fish， 1971， 37(3)： 176 185 3 张晓华海洋微生物学青岛：中国海洋大学出版社 ， 2007 4 吴后波，潘金培病原弧菌的致病机理水生生物学报， 2003， 27(4)： 422-426 5 张晓华，钟英斌，陈吉祥哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学及检测技术中国海洋大学学报 (自然科学版 )2007， 37(5)： 740 748 6 Garrity,G M (2005) Bergeys Manual of Systematic Bacteriology,2nd edn V01 2：The Proteobacteria.New York： Springer-Verlag 7 陈献稿，吴淑勤，石存斌，李宁求斜带石斑鱼病原菌 (哈维氏弧菌 )的分离与鉴定中国水产科学， 2004， 11： 313 317 8 吴后波，潘金培病原弧菌的致病机理水生生物学报， 2003， 27(4)： 422-426
