1、毕业论文 文献综述 生物 技术 Rapd的研究进展 摘要 ： RAPD 技术分子标志技术中的一种，是一项多态检测新技术。它利用 PCR 反应将引物中的碱基与基因组 DNA 中互补顺序配对，从而产生多态性 DNA 普带。 RAPD 应用非常广泛，可以用于中药生物的鉴定、植物育种等方面 1。本文着重从 RAPD 的原理，以及它的优缺点， RAPD 在各方面的应用来阐述 。 关键字： 分子标志； RAPD 技术；应用； DNA 分子标记主要有 RFLP(限制性片段长度多态性 )、 RAPD(随机扩增多态性 DNA) 、AFLP( 扩增片段长度多态性 )、 STS(序列标记位点 )、 SSR 或 SS
2、LP( 简单重复序列 ) 和 DNA指纹技术等几种 .其中 RAPD技术是 1990年由 williams和美国加利佛尼亚生物研究所科学家 Welsh 几乎同时发展起来的一种探寻物种多态性的分子生物学方法 2。该技术具有快速、准确等优点，因此一开始受到生物学家的高度重视。 RAPD 是 运用 PCR 原理 , 以随机设计的寡核苷酸引物扩增总 DNA 中的一些片段 的技术 ，发展至今，短短几年时间，被用于品种鉴定、分类研究、系谱的分析，遗传图谱的构建、突变体检测、基因定位等遗传、育种领域等其他诸多领域 3。鉴 于 Rapd 技术的简便、迅速，适用范围广，在越来越多的研究中发挥重要的作用，其应用前
3、景非常广阔。 1.RAPD 技术 1.1 原理 以样品 DNA 为模板，以一个人工合成的随机寡核营酸序列（通常 10 个碱基对 )为引物，通过对所研究的基因组 DNA 进行 PCR 扩增反应，电泳分离，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离后，经 EB 染色后紫外凝胶成像系统来检测其扩增产物 DNA 片段的多态性，这些扩增产物 DNA 片段的多态性即反映了基因组相应区域的 DNA 多态性 4。 RAPD 是用短的随机序列 DNA 作为引物对基因组 DNA 进行 PCR 扩增而产生的多态性 DNA 片段，所用的一系列引物 DNA 序列各不相同，但对于任一特定的引物，它同基因组 DNA 序列有其特定的结合位点
4、 5。一个单引物与基因组 DNA 混合，在耐热DNA 聚合酶和合适的缓冲系统存在下进行经典的 PCR 热循环。模板在 92-94变性解链后，在足够低的温度 (35-370C)下，根据碱基互补原则，单个引物退火到基因组 DNA模板两条反向链的不同位置上，在有足够的 DNA 聚合酶活性条件下， dNTP 从引物的 3端掺入，接上与模板 DNA互补的各种单核普酸，延伸到一定长度得到一段新的互补 DNA链。在基因组上，某一引物可能会 与单链 DNA 的多个位点互补结合，但只有这些引物的位置是在彼此可扩增的距离内 (引物间距为 200-2000bp)，一组不连续的分子量为200-2000bp 的 DNA
5、 片段就会通过 PCR 产生。因此，如果基因组在这些区域发生 DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应变化，而使 PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变而产生多态。通过 PCR 产物的检测即可检测出基因组 DNA 在这些区域的多态性。由于进行 RAPD 分析时可用引物量很大，虽然对每一个引物而言其检测基因 DNA 多态性的区域是有限的，但是利用一系列 引物则可使检测区域几乎覆盖整个基因组，因此， RAPD 可以对整个基因组 DNA 进行多态性检测。 1.2 优缺点 优点： 材料：取材广泛，不受季节和组织器官发育时期的限制对时间特异性、组织特异性要求不高，不随组织或发
6、育段而异，从植物体任何部位提取的 DNA 均可用于分析 6。 模板： 1. RAPD 分析只需少量模板。 2.可供 RAPD 检测的 DVA 标记位点数量多。对模板的质量要求不是很高。 4. RAPD 标记可以覆盖整个基因组，包括编码区和非编码区，可以反映整个基因组的变化。 引物： 1.没有严格的种属界限，同一套引物可用于任 何一种植物的研究，并且这些引物对任何基因组研究是通用的，具有广泛性和通用性，不需要建立文库或筛选探针。2.不需要预先了解目的。基因和相应的序列，而常规 PCR 必须通过已知程序设计特定的引物 3.引物。具有普遍的适应性，适用于自动化操作分析。 反应条件： (1 ) RAP
7、D 退火温度低，一方面保证引物与模板的。稳定配对，提供更多的检测位点 2.分析自动化，无需使用同位素或其它放射性标记，试验过程中也不需要进行 Southern 转移和分子杂交等步骤。 生长环境：不受环境影响，其变异源于等位基因 DNA 序列的差异，排除了由于环境差异造成的表型差异 7。 基因定位与图谱的构建： RAPD 分子标记具有更大的随意性，它在基因定位上可以快速定向寻找与所定位基因相连锁的 DNA 标记 8。 RAPD 技术可直接对基因组进行连锁标记作图，引物设计是随机的，不需要预先知道特异位点的信息，这就避开了 RFLP 和重复序列基因组作图的预备性工作。 缺点： 1.稳定性较差， P
8、CR 反应对反应条件极为敏感，反应条件的细微变化都可能影响到试验结果的重复性，因此要求严格的反应条件才具有重复性。 2.分子标一记技术不能区分显性纯合基因型和杂合基因型，因 RAPD 标记在大多 数情况下是显性标记，只有在极少数情况下才表现为共显性标一记。 3.通用性不好，不同物种对 PCR 反应条件的要求人不相同，因而，没有统一的 PCR 反应条件，不能形成通用的反应模式。 4.受其它反应条件的影响大，不同的实验室，不同的时间、地点、操作者都有可能得到不同的试验结果。5.易产生假带，排除假带，对于大量样品的检测，重复试验则带来一定的麻烦，另外由于 RAPD所用的引物通常比一般的 PCR反应引
9、物短，这进一步增加了重复试验的难度 9。 1.3 RAPD技术体系的优化 由于 RAPD 稳定性和可重复性较差，在某种程度上限 制了这一技术的应用。因此，在做 RAPD 试验之前都要先做反应体系优化考察 10。 RAPD 体系的传统优化一般采用多次单因素设计方法，例如陈析丰等通过单因素试验，优化得到山茶花的 RAPD 反应体系，并对在优化过程中各因素的作用加以讨论。此外，陈大霞等也通过单因素试验得到优化的黄连中药材的 RAPD 反应体系，并探讨了 RAPD 技术用于中药黄连分子标记研究的可行性。然而，单因素设计试验不仅试验次数多、工作量大以及浪费试剂，而且各因素之间的动态交互作用影响，不容易快
10、速得到优化反应体系，即使得到某一优化体系，有时也会出现不稳 定的现象。而正交设计是用正交表安排试验，用统计学原理来研究各因子试验的一种设计方法 11。它所安排的试验具有整齐可比和均衡分散的特点，可以全面了解试验的情况和各因子之间相互影响的规律。所以正交设计试验从多因素试验结果中得出优良的反应体系，同时又避免了传统的繁琐且没有统计学意义的优化过程。张建军等通过五因素四水平正交试验设计的 L16(45)，优化了萝卜基因组 DNA RAPD-PcR 反应体系 12。通过条带数目和清晰度的直观观察，并经过重复性试验确认 13 号试验体系重复性好，且带型清晰。滕兆岩等利用正交设计法 对影响 PCR 扩增
11、效果的一些因素诸如死口 DNA 聚合酶的用量、 Mg2+浓度、 dNTP 以及引物浓度等指标进行筛选和优化。然后，通过引物对该优化结果进行验证，最终得到适合星星草 RAPD-PCR 的反应体系。 然而，对于一些遗传距离很近的物种， RAPD 标记由于本身技术的不稳定，就很难扩增出一些种内的特异性片段。所以，有些学者就使用双引物进行 RAPD 扩增，这样可以有效增加多态性位点，从而获得更丰富的 DNA 指纹信息。李丽等也通过对番茄京丹1 号和毛粉 802 的 F1 代杂交种纯度进行鉴定的试验研究证明了双引物的扩增反应对鉴定双亲亲 缘关系极近的杂交种纯度较单引物扩增反应更有效 13。李湘阳等对同一
12、细胞中的第 4 号具随体染色体及剩余 20 条非随体染色体，进行 DOP-PCR 扩增，分别以随体染色体及非随体染色体的 DOP PCR 产物为模板，用成对随机引物进行 RAPD 分析，并获得了属于随体染色体特异性片段 14。在试验中还发现用单个随机引物进行 PCR 扩增时，试验结果的重复性较差，而用双引物却能得到较稳定的试验结果。 2.RAPD 应用 2. 1 在药材中的应用 随着中药现代化发展的需要，中药材的标准化种植越来越重要，期中不分药材还需引种。在引种药材 中如果地理和气候等环境发生变化，极易引起长期栽培药材的遗传变异。 RAPD 技术除中药鉴别外，在中药材种质资源和栽培方面同样可以
13、发挥有效作用，由于操作简单，可以作为常规的质量检测标准，甚至有可能在人工栽培中药材发生遗传表型变异前，从 DNA 水平提早发现变异 15。除此之外， RAPD 技术在中药材研究的结果中药资源库的建立、中药品种改良、重要目的基因的筛选于克隆以及为基因芯片在中药鉴别中的应用等领域都会有所借鉴。 分子生物学技术在中药材鉴别方面，并不能解决所有问题，它是现有鉴别方法的重要补充，特别是近源物种的鉴别方 面，优于其物物种鉴别提供更加可靠的技术手段 16。DNA 指纹技术中所需的样品极少，目的基因容易获得，并且在此基础上可作多种分析，因此得到了广泛的应用，普遍应用于种属分类、亲缘关系分析、物种起源鉴定、目的
14、基因的筛选、作物育种等多个领域。近几年，国内外学着应用 RAPD 技术对中药材的遗传变异、物种分类。政委鉴别等方面进行了不同深度和广度的研究，取得了一定的研究成果 17。 2.2 构建遗传图谱 RAPD 是一种显性标记，符合孟德尔遗传定律，不能区分杂合型和纯合型，因此在遗传分析及遗传图谱的构建等一些方面受到限制 18。但是也有相应的解决办法，将 RAPD条带作为单剂量标记，单剂量标记 (single dose RAPD markers)是从两物种和其杂交产生F1 代的分子标记中选择的 19。选择构建图谱用的标记有两个原则：一是它们必须在一个亲本中存在而在另一个亲本中不存在；其次是它们在后代中必
15、须以 1： 1 分离。这种方法相当于一个杂合体和一个隐性纯合体的测交，称为双向假测交 20。在多倍体植物中，不论基因组是如何组成的 (异源多倍体或同源多倍体 )，也不论材料的多倍性水平如何，单剂量的标记都相当于简单的等位基因 (同源多倍体 )或相当于二倍体基因座上的杂合等位基因 (异源多倍体 )21。因此，根据这些单剂量标记的连锁情况可以构建分子图谱。RAPD 条带作为单剂量标记使那些基因组 DNA 含量大，生长周期长的乔木和多倍体植物的遗传图谱研究走出了几乎停滞的状态。 Grattapagalia 则利用这种策略首先构建了巨按和尾叶桉的分子连锁图谱 22。 Beedanagari 利用这种策
16、略构建了美国山核桃数的分子连锁图谱 23。姜廷波等引通过以 80 个来自欧洲白桦与中国白桦的 F1 个体为作图群体 24。利用 RAPD 标记，按照拟测交的作图策略，分别构 建了欧洲自桦和中国白桦的分子标记连锁图谱 25。 2.3 其他方面的应用 20 世纪 90 年代以来 RAPD 标记广泛应用于动、植物遗传育种和基因诊断，居群遗传学、生物系统学与进化研究、药用植物的种质资源和鉴别研究等 26。 RAPD 应用于遗传多样性和系统学研究中的问题。在研究银杉的遗传多样性时 ,对RAPD 产物的影响因素进行了大量的实验探索 , 结果表明 :逐级纯化的 DNA 模板的RAPD 结果一致 , 因而模板
17、制备过程中的很纯化步骤是不必要的 ; RNA 对扩增产物无影响 ;模板浓度在一个相当大的范围内不影响扩增结果 ;干叶和 鲜叶中提取的 DNA 可获得一致的扩增产物 ;从而证明 RAPD 产物具有很好的重复性 27。进而讨了 RAPD 产物分析及数据分析中的一些问题 28。通过对升麻属 5 种、类叶升及松潘乌头的 RAPD 结果分析 , 认为 RAPD 方法可用于种间乃至缘属间的系统学研究 , 但有一定的局限性 29。 RAPD 分子标记技术在中药材百合研究中的应用。百合为百合科百合属植物卷丹、百合 L 和细叶百合 L 的干燥肉质鳞叶，为临床常用中药材，也是湖南省大宗道地药材之一 30。对中药材
18、百合的鉴定，国内外文献资料中报道主要采用的方法是性状鉴别、显微鉴 别和理化鉴别，目前从分子水平探讨其遗传差异并对其进行鉴别仅见一篇相关研究报道。本研究应用 RAPD 技术对湖南、甘肃、江苏、江西、广西五个产地的百合及大百合进行了分析，探讨了分子生物学技术在中药材百合品种品系鉴定及亲缘关系分析上的应用，为鉴定中药材百合品种品系的新方法提供了充分的实验依据 31。 4 结束语 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)是指随机扩增多态性 DNA 它以一个 10碱基的任意序列的寡核普酸片段为引物在未知序列的基因组 DNA 上进行随机 PCR 扩增。它是一种新的 DN
19、A 分析技术，由美国 Williams 和 Welsh 于 1990 年分别提出，它是建立在 PCR(Polymerase Chain Reaction)基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析 DNA 分子标记技术，技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。 参考文献 1 王劲松 ,张剑侠 ,万怡震 .分子标记及其在葡萄属植物研究上的应用 J.河北职业技术师范学院学报 ,2001, 15 (4) : 54-56. 2 Ramming DW,Ledbetter CA,Tarilo R. Hybridization of seedless grapesJ Viti
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