1、毕业论文 文献综述 生物 技术 根霉原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究 摘要： 利用双亲热紫外灭活原生质体，获得融合菌株。通过测定透明圈直径，比较融合后代与亲本之间的酶活高低。 关键词：原生质体 热紫外 双亲灭活 透明圈 1 前言 根霉是酿造业中的重要微生物，其生长过程中分泌的蛋白酶和谷氨酰胺酶等对酱油、豆瓣、米酒等传统发酵食品的产率和风味起着非常重要的作用。然而在生产实践中，米曲霉菌株的生长速度的快慢和其分泌蛋白酶活性的高低很难同时兼得。因此，通过灭活原生质体融合技术选育生长速度快且蛋白酶 活性高的米曲霉菌株是目前研究的热点。 原生质体融合是进行遗传育种研究的重要手段，也是
2、获得菌种融合体和重组体的有效方法。但是亲本菌株遗传标记的诱变筛选较费时费力，而且会带来一些不良突变。利用双亲灭活原生质体作为供体进行融合是近年来选育曲霉的重要方向。所谓“双灭活”就是将两种菌株的原生质体用不同的理化手段进行处理 , 相应地使其某一小部位的生理结构被损伤而失去活性 , 但决不是彻底杀死。灭活后的原生质体不能再生 ， 而由损伤部位不同的原生质体相结合形成的融合子 , 因损伤部位互补则可以再生。本实验是利用热紫外双亲 100%灭活融合，再用透明圈法测定酶活力从而观察后代酶活的高低。 2 原生质体制备与再生 微生物细胞一般是有细胞壁的，进行该项技术的第一步就是制备原生质体。现在去除细胞
3、壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体形成的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长期或生长中后期的菌，也有的采用生长后期的这主要是由于对数生长期细菌的壁中肽聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感，但是对数生长早期的菌相对较为脆弱，受酶的过度作用会影响原 生质体的再生率。彭智华等进行原生质体制备的过程中，用 2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。陈海昌等证明，在一定范围内，酶作用的时间、酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关，而与再生率成反相关。林红雨等采用酶解 lO分钟后补加 EDTA的方法，改变酶解
4、环境中的离子强度和渗透压，可以提高原生质体形成率。 costemn J w等 (1967)报道，在高渗 Tris溶液中添加 1 5聚乙烯吡咯烷酮 (PvP)等原生质体扩张剂，有助于制备原生质体，添加 o 02ml L镁离子，有利于原生质体的定据。本实验采用：纤维素酶、溶壁 酶、蜗牛酶以 7： 3 ：1的比例酶解效果做好。 3 原生质体灭活 3 1灭活原理 紫外线对微生物营养细胞的杀灭作用主要与细胞内的核酸的光化学变化有关，其灭活的机制主要包括产生嘧啶二聚体以及 DNA解螺旋。在不同的原生质体中，紫外线照射致死损伤的 DNA部位有所不同，所以灭活后可以互补而融合。而热的作用可使细胞内有功能蛋白、
5、酶蛋白变性失活。 3 2最佳灭活条件的确定 稀释后的原生质体溶液于 15W紫外光线下照射 1、 3、 5、 10、 15min,然后每皿取 1 mL，涂布接种在高渗 CM平板上，于 28恒温培养 48 h后进行菌落计数；同时进行重复试验。按以下式计算灭活率 ： 灭活率 =（灭活前高渗 CM平板上菌落数 -灭活后高渗 CM平板上菌落数） /灭活前高渗 CM平板上菌落数 100% 以灭活率刚好达到 100，即灭活后在再生平板上生长率为 0时为最佳灭活条件。 同理热灭活在 60下按照时间 10、 15、 20、 25、 30来确定最佳灭活时间。 4 双亲灭活原生质体融合 物理法：用物理的手段 (如电
6、场、激光、超声波、磁声等 )使亲本的原生质体发生融合。最常用的主要有电处理融合法、激光诱导融合法以及在电融合技术上改进的方法等。优点：电融 合条件可控，融合率高，无毒。缺点：设备条件要求高，费用较高。 生物法：紫外灭活的病毒膜片能使细胞间产生凝聚和融合。病毒制备困难，操作复杂，试验重复性差，融合率很低，适用于动物细胞融合。 化学法：用化学融合剂促进原生质体融合。化学试剂中最常用的是 PEG结合高 Ca2+、 pH诱导法。优点：不需要特别的仪器设备，操作简便。缺点：原生质体聚集成团的大小不易控制，且 PEG本身对原生质体具有一定的毒性，可能影响原生质体的再生，另外融合率不高。 本实此次采用 PE
7、G，研究表明，时间过长或 PEG浓度过高都将因 PEG对原生质体的 毒性而使 融合率 降低。时间过短 , 原生质体虽融合但不稳定 , 而 PEG 浓度低则其提供的渗透压也低 , 不利于融合 , 因此相应的 融合率 较低。 5 融合子筛选 接种到综合马铃薯培养基上进行培养得融合菌株。制备各融合菌株的孢子悬液，稀释到合适浓度接种至酪素平板上， 28培养 72 h，测定其透明圈直径与菌落直径的比值(Hc)，以 Hc值比较蛋白酶活力的高低。 6 蛋白酶水解酪蛋白透明圈初筛 在蛋白酶菌种选育过程中 , 对其产酶性能的测定 , 是采用福林 folin法测定蛋白酶活力 , 即利用蛋白酶分解酪素 , 生成含酚
8、基氨 基酸的呈色反应来表示蛋白酶的活力。采用福林法测定蛋白酶活力 , 程序复杂 , 在筛选大量单株的过程中 ,其中个别理想变异株出现的机率甚低 , 如果均采用福林法一一测定 , 将必然造成大量的人力物力消耗。因此 , 最好事先进行一次初筛 , 淘汰大量负变株 , 然后再用福林法进行复筛 , 则可节省大量工作量。目前蛋白酶菌种选育的初筛方法 , 是利用蛋白酶水解酪素 , 从而在酪素琼脂培养基上形成透明圈的方法 , 以透明圈直径大小 , 相应判断其酶活力的高低。但是 , 该法在曾应用的过程中 , 透明圈直径与酶活力之间的正相关性 , 受到某些因素的 很大干扰 , 因而给初筛工作造成极大困难。到目前
9、为止 , 这种初筛方法尚不能有效地应用于选育工作。 从酶液透明圈实验结果显示：将酶液稀释成不同倍数后 , 即在酶液中酶活力逐减的情祝下 ， 透明圈直径也相应地逐步减小。试验结果表明 ， 酶活力与透明圈直径呈正相关。此外 ， 当酶液处于高浓度时 ， 不同酶液之间 ， 透明圈直径无明显差异。但经稀释以后 ， 不同酶液所产生的透明圈 ， 则随酶活高低而出现了相应的正相关现象。这说明了酶液的酶活高低与透明圈直径呈正相关。并且将酶液进行稀释后 , 再用透明圈法进行初筛 , 则结果更为精确。从菌落 透明圈试验结果 , 初步验证了透明圈直径大者 ， 以大圈高酶活的正相关性占优势。而透明圈直径小者，以小圈低酶
10、活的正相关性占优势。但是 , 其中仍有少部分菌落出现一定程度的负相关性。其中干扰因素复杂 ,原因尚不明确 , 有待于进一步探索。 7 小结 原生质体融合技术能把亲缘关系比较远，甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段，它不仅打破了有性杂交重组基因创造新种的界限，更重要的是扩大了遗传物质的重组范围，已经成为遗传育种的重要手段，寻找具有更高融合效率的方法有着重要 意义，而灭活原生质体融合是细菌原生质体融合技术的重大发展，大大减少了筛选的时间与成本。这是原生质体融合技术的新发展。 参考文献： 1 唐洁，车振明，李明元，罗海，不同灭活方法在原生质体融合选育
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