分子标记技术在水产动物表型性状遗传分析中的应用【文献综述】.doc

1、毕业论文 文献综述 生物 技术 分子标记技术在水产动物表型性状遗传分析中的应用 摘要： 综述了 DNA 分子标记技术的类型及代表性分子标记技术的基本原理和优缺点。 随着 DNA 分子标记技术的发展 , 其在动物遗传上发挥了重大作用 , 使用 DNA 分子标记可以观察到整个基因组的遗传多样性。 DNA 分子标记的应用使得人们对遗传多样性、近亲繁殖、种类和品系鉴定以及遗传连锁图谱建立的研究都取得了很大进展 , 也加快了数量性状位点 ( QTL) 基因的鉴定作为分子标记辅助选择 ( MAS) 的研究。 关键字： 分子标记 遗传 技术 近年来 , 随着生物技术的不断发展 , 诞生了一系列 DNA 分子

2、标记技术 , 如限制性片断长度多态性 ( restriction fragment length polymorphism,简称 RFLP) 、随机扩增多态性 DNA( randomamplified polymorphic DNA, 简称 RAPD) 、扩增片断长度多态性(amplified fragment length polymorphism, 简称 AFLP) 、简单序列长度多态性 (simple sequence length polymorphism, 简称 SSLP)、随机扩增微卫星多态性 (Random amplified microsatillitepolymorphism

3、, 简称 RAMP) 、序列标签位点 ( Sequence-tagged sites, 简称 STS) 、 DNA 扩增指纹 (DNA amplified fingerprinting, DAF) 、扩增子长度多态性 ( amplicon length polymorphism, 简称 ALP)、特异扩增子多态性 ( Specific ampiliconpolymorphism, 简称 SAP) 、单链构象多态性 ( single strand conformation polymorphism, 简称 SSCP) 和单核苷酸多态性 ( single nucleotidepolymorphis

4、ms, 简称 SNPs) 等。 DNA 分子标记 具有以下多种优点： ( 1)直接以遗传物质 DNA 的形式表现 , 在生物体的不同组织和发育时期均可检测到 , 受季节和环境的影响较少 ; ( 2) 数量多、分布广 , 遍及整个基因组 ; ( 3) 多态性高 , 自然存在着许多等位变异 , 不需专门创造特殊的遗传材料 ; ( 4) 表现为“ 中性” ,即不影响目标性状的表达 , 与不良性状无必然的连锁 ; ( 5) 有许多分子标记表现为共显性 ( codominance) , 能够鉴别出生物品种或品系的纯合基因型与杂合基因型 , 为育种利用提供极大的便利。 1、分子标记技术的种类、基本原理及优

5、缺点 1.1 RFLP RFLP 是 Grodzicker 于 1974 年创立的。该技术最早用于 DNA 水平上的品种鉴定分析。其基本原理是首先利用特定的限制性内切酶将生物基因组 DNA 进行酶切 , 获得大小不等的 DNA片断 , 然后通过凝胶电泳分析形成不同的条带 ,最后经 Southern 杂交和放射自显影 , 即可揭示出 DNA 的多态性。但是 , 由于 RFLP 的技术要求高 ,检测时间长 , 且成本较高 , 使得大规模应用受到限制。 1.2 RAPD RAPD 是 1990 年由美国杜邦公司科学家 Williams 和加利福尼亚生物研究所的Welsh 等发明的一种分子标记技术。它

6、是以基因组 DNA 为模板 , 以一个随机的寡核苷酸序列作引物 , 通过 PCR 扩增 , 产生不连续的 DNA 产物 , 用以检测 DNA 序列的多态性。它可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下 , 对其进行基因组指纹图谱的构 建。与RFLP 技术相比 , 具有 DNA 用量少、简单快速、引物无种属特异性和不使用放射性同位素等优点。但是 RAPD 技术也有以下不足之处 : ( 1) 稳定性差 , 结果重复性不好 ;( 2)RAPD 一般为显性标记 , 不能鉴定杂合子 ;( 3)RAPD 标记在基因组中分布不均匀 , 每个标记提供的信息量较少。 1.3 AFLP AFLP 是荷兰 Keyg

7、ene 公司 Zabeau 等发明的一种 DNA 分子标记技术。其基本原理是选择性扩增基因组 DNA 的酶切片段 , 由于不同材料的 DNA 酶切片段存在差异 , 因而便产生了扩 增产物的多态性。选择性扩增是通过在引物 3端加上选择性核苷酸而这现的 , 改变选择性核苷酸的数目 , 就可以预先决定所要扩增的片段的数目。研究表明 , AFLP 产生的多态性远远超过 RFLP 和 RAPD 等技术 , 因而被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。但该技术已申请专利 , 在生产及商业上的应用受到一定的限 制。 1.4 SSR SSR 是简单序列重复 , 称为微卫星 DNA(microsatall

8、ite DNA) , 是近几年在 PCR 基础上发展起来的第二代分子标记。 SSR 是一种真核生物基因组中普遍存在的 重复序列 , 重复序列一般由 1 6 个碱基组成 , 重复次数在不同物种或同一物种不同基因型之间是高度可变的。这些重复序列两端大多是保守的单拷贝序列 , 因此可以根据保守序列设计特异引物 , 通过 PCR 技术将中间的核心重复序列扩增出来 , 利用琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析技术可获得其长度多态性。 SSR 具有 RFLP 的所有遗传学优点 , 且避免了 RFLP 技术中的使用放射性同位素的缺点 , 又比 RAPD 的重复性和稳定性高 , 因而目前已成为遗传标记中的研究热

9、点。然而由于 SSR 技术必须针对每个染色体座位的微卫星 , 发现其两端的单拷贝序列才能设计引物 , 这给微卫星标记的开发带来一定的困难。 1.5 ISSR ISSR 是一种新型的分子标记 , 是由 Zietkiewecz 于 1994 年创建的一种简单序列重复间扩增多态性的分子标记。它的生物学基础仍然是基因组中存在的 SSR。 ISSR 标记根据生物体中广泛存在 SSR 的特点 , 利用生物体基因组中出现的 SSR 本身设计引物 , 无需预先克隆和测序。 ISSR 通常为显性标记 , 呈 Mendel 式遗传 , 且具有很好的稳定性和多态性 , 因而是非常理想的分子标记之一 , 可用于构建

10、PCR 为基础的分子图谱。但它与 RAPD 相似 , 不能鉴别检测位点的纯合与杂合状态。 1.6 SNP 1994 年 , SNP 这个术语第一次出现在人类分子遗传杂志上 , 随后 Lander13第一次正式提出 SNPs 为新一代分子标记。简单地讲 , 它是指基因组 DNA 序列中由于单个核苷酸 (A, T, C, G) 的替换而引起的多态性。因此 , 通常所说的 SNPs 不包括碱基的插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。 SNP 是继 RFLP 和 SSR 之后发展起来的第三代分子标记技术。与前两代分子标记技术相比 , 它具有以下优点 : ( 1) 数量多 , 分布广泛。它是目前为止分布最

11、为广泛、存在数量最多且标记密度最高的一种遗传多态性标记 ; ( 2) 遗传稳定性高 , 遗传分析重现性好且准确性高 ; ( 3) 易于快速且高通量地进行基因型分型。由于 SNP 的二态性 , 非此即彼 , 在基因组中往往只需 /的分析 , 而无须象检测 SSR 标记那样分析片段的长度 , 这就有利于自动化的筛选或检测技术的开发。 2、水产动物的表型性状遗传特点 2 1与鲤鱼抗寒性状相关的 RAPD 分子标记 在利用 RAPD2PCR 技术研究鲤鱼抗寒性状的过程中 ,最希望得到的 是抗寒的父本和越冬存活的 F2代混合样具有的分子标记 ,而不抗寒的母本和越冬死亡的 F2代混合样都不具有的分子标记。

12、但在本研究中发现 ,所筛选到的几个标记都是抗寒亲本具有、不抗寒亲本不具有 ,而两个 F2代混合样都具有 ,但在PCR 扩增量上抗寒与不抗寒 F2代存在差异 ,即产生了一个拷贝数差异的图谱。分析认为 ,鱼类在越冬过程中引起死亡的原因有很多 ,遗传因素决定其不抗寒是引起越冬死亡的主要因素 ,由于操作不当对鱼体产生损伤引发疾病也是产生死亡的一个因素。因此在越冬过程中很可能造成的极少数具有抗寒能力的子代混入到死亡群体中 ,从而 产生上述的结果。另外 ,作者认为鱼类在某些与抗寒相关基因的表达量上存在一定的差异 ,而表达量达不到一定水平很可能是引起越冬死亡的另一个因素。在以往利用分子标记进行抗寒分析过程中

13、 ,笔者获得了许多与抗寒性状相关的分子标记 ,据此确定鱼类的抗寒性状是受多基因控制的是一个数量性状 ,一个基因拷贝数的不同对抗寒鱼群体之间的遗传不同有很大的影响。而在提高鲤鱼抗寒能力的育种研究过程中 ,亲本将抗寒性状向子代传递 ,子代获得抗寒基因的几率就会出现不均一的现象 ,在子代基因组中获得与抗寒相关基因的拷贝数必将有所不同。作为数量性状遗传的抗寒 基因只有在相关基因拷贝数达到一定时方能表达出与该基因相对应的蛋白产物 ,抗寒 F2代的表现型为对低温有较强的抵抗力 (低温存活 ) ,而不抗寒的 F2代在一定程度上也获得了亲本遗传的抗寒基因 ,但在遗传抗寒基因的数量上 (拷贝数 ) 未达到产生足

14、以抵御低温的表达产物蛋白质的量 ,导致其表现型为抗寒能力弱或不抗寒 (低温死亡 ) 。因此 ,在 PCR 扩增后出现的扩增量不同的特异片段有可能与亲本的抗寒性状在传递过程中基因拷贝数多少有关 ,笔者将在后续的研究工作中做进一步的研究。 由于 RAPD 技术具有的操作简单、快捷、无需知道目标序列的 有关信息、无种属特异性等优点 ,这对研究背景相对贫乏的鱼类抗寒研究进入基因组水平是非常有意义的。但由于 RAPD 技术存在的重复性差、实验结果不具有可比性等缺陷使其在数量性状基因的定位等研究上难以进行。 Weeden 等的研究也表明 ,RAPD 技术本身存在 5 % 10 %的检测误差。因此目前采用的

15、 RAPD 技术并不是进行鱼类抗寒研究的最好方法。在今后的研究中 ,应该更多的采用共显性分子标记。同时 ,在实验过程中 ,虽然通过严格的控制实验条件 ,比如 ,获得高质量的模板、稳定高效的 Tag 酶、优化的反应条件、专一的实验器材 ,利用 RAPD 技术依然能够得到重复性好 ,且比较稳定的实验结果。但是其信息量少 ,进行常规 PCR 困难等缺点 ,需要将其转化为共显性分子标记才得以解决。 SCAR 标记作为一种共显性的分子标记具有的重复性好、信息量大等一些优点 ,已经被越来越多的国内外学者应用。比较 RAPD 分子标记而言 ,这种共显性的 SCAR 标记更加适合鱼类抗寒性状方面的研究 ,在鱼

16、类耐寒育种研究问题上具有更加广阔的应用前景。 2.2对虾抗病性状遗传标记 抗病性状一般有多个基因控制。分子标记辅助育种主要用于单基因或少数基因的遗传转移和抗病性状多个基因 的聚合。在抗病性育种实践中，单个基因控制的抗性品种容易被病原体克服而造成大面积流行。因此，利用分子标记技术对抗病基因进行标记和定位，然后将不同的抗性基因聚合到一个优良品种中，可能会产生新的抗性或使抗性得到提高，从而有利于培育具有持久抗性的品系或品种 (周锦霞等 2005)。 Huang等 (1997)用分子标记在杂交 F4代将 4个抗白叶枯基因 (Xa一 44， Xa一 5， Xa一 13和 Xa一 21)聚于 IRBB60

17、品系中。王心宇等 (2001)采用在早代进行抗性鉴定，较晚世代 (F4代 )进行抗性鉴定结合分子标记辅助选择的策略，利 用了与 3个小麦白粉病抗性基因紧密连锁或共分离的 RFLP标记和 PCR标记 (SCAR标记 )，对含有这些基因的优良品系间配制的杂交组合的 F4代进行了分子标记辅助育种选择，并结合抗性鉴定，筛选到共 36株结合其中两个抗性基因的植株。 本研究利用 RAPD技术对在攻毒过程中分离出的两个群体进行分析，得到 7个在两个群体中表型频率差异显著的位点，其中 5个位点在 SLT群体中的表型频率显著高于 SST群体，说明这 5个位点可能与抗病性状相关。另外，两个位点 S1020 4和

18、S1176 4在 SST群体中的表型频率显著高于在 SLT群体， 说明这两个位点可能是与抗病负相关的特异性遗传标记。其中引物 SLO2O产生两个特异性位点，一个与抗病正相关位点 SLO2O一 1，一个负相关位点 S1020 4。利用这些与抗病相关的遗传标记进行辅助育种，可以大大加快育种进程。 3、分子标记技术的在水产动物表型性状遗传研究中的应用 3.1 RAPD技术在鱼类、虾蟹类研究中的应用 3.1.1在遗传资源研究中的应用 目前，海产虾、蟹类遗传变异的检测大多通过检测同工酶的变异来进行，所揭示的同工酶的多态性相对较低。 RAPD分析中所需的样品量极少，其操作程序简单易行，实验周期 短，因而可

19、以对数量较多的样品进行分析。利用一套引物可得到不同种属、品系、群体甚至是个体的大量的 RAPD分子标记，并可借助于计算机进行系统分析， RAPD技术的这些特点使得它可以在虾、蟹类群体遗传学、遗传多样性分析中发挥重要作用。 RAPD标记可以用来进行虾、蟹类群体遗传学研究，检测种群内、种群间的遗传多样性水平，并为种群识别提供可靠的遗传标记。 Garcia等尝试在斑节对虾中利用 RAPD分析不同地理群体间的遗传多样性，并就其在虾类选育中的应用作了初步探讨。 Garcia以及A1civar Warren 等 在 高 健 康 (High Health Shrimp) 和 无 特 异 病 原(Specif

20、ic Pathogen Free,SPF)的南美白对虾培育中，用 RAPD技术对野生种群以及不同的家系进行监测和分析，发现其多态位点的比例为 50%左右，其中一个家系的多态位点比例高达 77%。刘萍等用 RAPD技术对中国对虾黄渤海沿岸种群亲本及子一代的基因组DNA多态性进行了研究，结果证实子代之间的遗传距离比其父母与子代之间更小，遗传变异程度更低。邱高峰等用 RAPD技术分析了我国近海烟台、长岛等 4个地方的 20只中国对虾的种群内和种群间遗传差异，结果表 明不同地理种群之间存在一定程度的遗传差异。石拓等 ,刘萍等、刘振辉等对中国对虾不同地理种群的遗传多样性进行了 RAPD分析，结果表明，中

21、国对虾的遗传多样性水平较低。高志干等对中华绒螯蟹的辽河和长江种群进行 RAPD分析，结果显示，其种内遗传变异较低， 3个种群中，辽河种群和颐江种群遗传变异较高，而长江种群遗传变异较低；辽河种群间遗传距离小于它们与种群间的遗传距离。甘西等利用 RAPD技术对罗氏沼虾的 NY群体和 NX群体的遗传多样性进行了研究， NY群体的变异明显小于 NX群体。宋林生等及庄志猛等用 RAPD技术研究了日本对虾 野生种群和养殖种群的遗传结构，结果表明，野生种群多态性位点的比例和杂合度明显高于养殖群体，说明中国沿海的日本对虾野生种群的种质资源状况较好，应加以保护。 一个较为详细的遗传连锁图谱不仅对该物种的遗传学基

22、础研究有重要意义，同时对该物种的育种研究也很有帮助。 Potlethwait和 Stephen等用 RAPD技术进行斑马鱼遗传连锁图谱的制作。 Liu把 RAPD技术应用到鲶鱼基因图谱研究中。孙效文等建立了鲤鱼的遗传连锁图谱。图谱有 RAPD分子标记 56个，鲤鱼的 SSLP标记 26个，鲫鱼的 SSLP标记有 19个，斑马鱼的 SSLP标记有 70个，鲤鱼基因标记 91个，图谱有 50个连锁组，连锁图给出鲤鱼的基因组大小在 5789cm左右。 3.1.2确定种、品种间的亲缘关系 种群亲缘关系的传统研究方法是从形态学、细胞学、生化指标等方面进行，但受个体和环境的影响较大，有时不能反映物种本身所

23、固有的特征。物种基因组的组成在 RAPD图谱上得到体现，亲缘关系越近，基因组中的同缘序列越多，则以相同引物扩增出的共有标记也就越多。因此， RAPD技术与传统方法结合是研究物种亲缘关系的有效手段。对不同种、同种不同群体的 DNA进行 RAPD分析，筛选出特征性条 带，计算相似系数和遗传距离，从而可确定它们的亲缘关系。李思发等用 RAPD技术研究中国沿海六水系绒螯蟹 (中华绒螯蟹和日本绒螯蟹 )群体的亲缘关系，从 48个引物中筛选出 2个具有群体特异性的引物，其中 Z2扩增的 880bp片段为珠江蟹和南流江蟹两群体所共有，扩增的 700bP片段为长江蟹、黄河蟹、辽河蟹、瓯江蟹四群体所特有。这可作

24、为区别中华绒螯蟹 (长江蟹、黄河蟹、辽河蟹、瓯江蟹 )和日本绒螯蟹 (珠江蟹、南流江蟹 )的分子遗传标记。用 RAPD技术对中国沿海六水系绒螯蟹进行两大类型划分与生化遗传差异分析、形态特征多元分析的结果 一致。宋林生等用 RAPD方法研究对虾属六个种间的亲缘关系，用 20个随机引物扩增，共得到 364条清晰稳定的多态性片段，根据扩增片段的共享度计算相对遗传距离指数，然后用 UPGMA和 NJ等聚类方法对其进行分析，构建系统树，确定了它们之间的亲缘关系。聚类分析的结果为：中国对虾、长毛对虾和墨吉对虾三者的关系最近，它们首先聚类在一起，然后与斑节对虾聚在一起，最后是南美白对虾和日本对虾。从其结果可

25、以看出，外部形态比较相似的种类在基因组 DNA上表现出较大的相似性，反之则较小。宋林生等用 RAPD方法研究六种海产虾类基因组 DNA多态性，结果显示六种虾的亲缘关系与传统的分类结果基本一致。谢浩等用 RAPD方法研究三种绒螯蟹的亲缘关系，用一组引物对每种各 10个个体的基因组 DNA进行扩增，得到一批特异、可重复的扩增图谱。扩增区带相似串的分析结果表明，中华绒螯蟹与日本绒螯蟹的亲缘关系较远，而南流江的绒螯蟹 (合浦亚种 )与日本绒螯蟹较近。 Borrwsky等用随机引物扩增产物重新构建了脊椎动物 DNA指纹图。 Sultman等用 DNA标记对丽鱼科鱼类的系统发育进行了研究。何舜平等运用 R

26、APD的方法对五种鲤科鱼类进行了分析，并论述了鮈鲫的系统位置。 何舜平等通过对鲤科鱼类的随机扩增，获得了大量有系统发育信息的 DNA多态片段，并绘制了低等鲤科鱼类代表属种的分支系统图。夏德全等用 RAPD方法分析太湖大银鱼、太湖新银鱼和寡齿新银鱼的亲缘关系，同时发现有个别样品的核基因组与太湖中已有的几种银鱼有显著差异。邹曙明等用 RAPD方法研究草鱼、柏氏鲤和 3个地理种群鲤的亲缘关系，研究结果支持中国东部鱼类具有双重来源性的观点。 3.1.3特定基因的标记 利用 DNA分子水平上的变异作为遗传标记进行基因标记已成为可能。周开亚等用RAPD方法研究鉴别中华绒螯蟹种群，用 200个随 机引物对中

27、华绒螯蟹辽河种群、长江种群和瓯江种群进行 RAPD分析，其中引物 HX01和 HX02检测到瓯江种群和辽河种群所有样品共有 HX01 0.4和 HX02 0.7扩增片段；而长江种群样品的 PCR反应中无这两个扩增片段出现，因而可作为长江种群的鉴别标记。未发现可区分瓯江种群和辽河种群的标记。谢浩等用 RAPD方法研究三种绒螯蟹的亲缘关系，用引物 OPO 05对 25个中华绒螯蟹个体、27个日本绒螯蟹个体及 12个日本绒螯蟹合浦亚种个体扩增，发现中华绒螯蟹所有个体都能扩增出一条大小约为 1kb的区带，且相当明显和稳定，而其 它两种在相同条件下仅有个别个体能扩增出相当微弱的区带。因此，可将这一区带作

28、为一个遗传标记，用于鉴别中华绒螯蟹与日本绒螯蟹及其合浦亚种。 目前 RAPD已广泛应用于鉴别、鉴定不同的生物种类。 Johnson用 RAPD技术鉴定了不同实验室品系的斑马鱼。薛国雄对长江、珠江、黑龙江三大水系的草鱼产卵场及太湖中捕捞的草鱼进行覆盖性的 RAPD分析，结果表明每一水系的草鱼种群均有其特征性基因图谱，可作为种群鉴定的依据。夏德全等应用该技术检测了一个奥利亚罗非鱼养殖群体和湘湖，美国和沙市三个尼罗罗非鱼养殖群体，获得了鉴别尼罗罗非 鱼和奥利亚罗非鱼的分子遗传标记。姚纪花等利用 20个随机引物对产于方正、彭泽和淇河地区的三个银鲫种群进行了 RAPD检测，也获得了银鲫种群鉴定的分子标记

29、。邓怀等对青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、鲤鱼、团头鲂、胭脂鱼、土鲶和黄颡鱼进行了 RAPD PCR扩增。结果显示RAPD是一种非常灵敏的种间鉴定技术，特别是对鱼卵和鱼苗的鉴定有重要意义。郑光明等以池养的鲮、麦鲮为材料，提取血液基因组 DNA，利用随机引物进行 PCR扩增，通过缩短扩增时间和电泳时间，快速鉴定了三种不同的鲮鱼，并建立了一套 DNA分子水平上的快速鉴定鱼种的 方法。 3.1.4识别同一物种的性别差异 虾、蟹的性染色体没有统一的模式，用常规核型分析方法不能鉴别性染色体。通过RAPD技术可找出同一物种不同性别的基因组 DNA特征性条带，从而有助于研究性别控制机制，也可为性别确定提供分子

30、依据。邱涛用 RAPD技术识别中华绒螯蟹的性别， 200个引物中有 17个引物扩增出群体水平的差异，其中一个引物 (OPM14)扩增出个体水平的差异：雄性有一个 800bP的特异带，而雌性没有。这可作为有价值的性别鉴别标记。 3.1.5监测遗传渗入，维持物种遗传多样性 目前，人为的养殖活动、人工放 流等使得虾、蟹类种内不同种群间非自然的遗传渗入已相当普遍，应引起重视，需加以监测并收集数据，为保护种质资源、维持物种遗传多样性提供依据。李思发等用 RAPD指纹标记研究中国大陆六水系绒整蟹的亲缘关系，引物 OPP17扩增的 947bP片段的出现频率，在长江、黄河、辽河三群体中显著地从南到北递减，长江

31、蟹 87.5%、黄河蟹 41.66%、辽河蟹 10.83%。这一遗传渗入的度量可作为区别三水系中华绒螯蟹的判据。邱涛等用 RAPD方法研究中华绒螯蟹长江、辽河、瓯江水系三群体的遗传多样性，并未发现三群体间存在特征性条带，但群体 间差异大于群体内差异。未发现群体间的分子遗传标记，但三群体间确实存在差异，表明近来种质资源混杂，遗传渗入是其中原因之一。 RAPD标记可用于群体遗传学研究，检测种群内、种群间的遗传多样性水平，并为种群识别提供可靠的遗传标记。 Bardakci等用 RAPD技术评估了罗非鱼的种群内、种群间的遗传变异度。 Bielawski等进行了太平洋海岸条斑鲈的 RAPD分析。 Cac

32、cone等对欧洲尖吻鲈的 DNA多态性进行 RAPD PCR分析。 Garcia等尝试在斑节对虾中用 RAPD分析不同地理群体间的遗传多态性，并就其在 虾类选育中的应用作了初步探讨。王绕梅等用 RAPD技术检测野生鲫鱼和四个金鱼代表种的基因组 DNA多态性。张德春用该技术对湖北、广西两个鲢鱼人工养殖群体进行了遗传多样性的比较研究，为链鱼人工繁殖的科学规范提供一定的理论依据。张四明等进行了中华鲟随机扩增多态性 DNA及遗传多样性研究，结果显示中华鲟天然群体核 DNA水平的遗传多样性较低，从而为中华鲟资源的监测和保护提供了理论依据。石拓等用该技术对中国对虾朝鲜半岛西海岸群体的基因组 DNA多态性进

33、行了检测，表明该对虾群体的遗传多样性水平较低。宋林生等对日本对虾野生群体和 养殖群体的遗传结构的 RAPD标记进行了初步的研究，并认为将 RAPD以及其他分子标记技术用于海洋动物的育苗育种中，进行标记辅助育种，是海洋动物增养殖健康发展的有力保证。 RAPD技术程序简单快捷，且无需事先确定目的基因的序列，无种属特异性，有无数的引物可供利用，能产生足够的多态性，无需同位索，可以鉴别物种之间和种群之间的基因组的差异，也可区分个体之间的差异。为此，许多从事水产育种工作的科研人员已把 RAPD技术应用到水产遗传育种上，并已取得 定的成果。在海水鱼类 (如大黄鱼等 )、海水虾类的种质资源研究中，由于同工

34、酶所揭示的种内水平上的遗传差异水平非常低，而 RAPD比同工酶更能指示 DNA多态性，因此 RAPD分子标记在鱼类、虾类、蟹类种质资源遗传学研究中有着广泛的应用前景。目前 RAPD分析主要应用于标记鉴定、遗传作图、系统发育和进化及亲缘关系的研究、种群的划分、群体遗传多样性研究等。但在实际应用中， RAPD也表现出不足，如显阳性位点，在后代中不能区别是纯合体还是杂合体；稳定性较差；高度的变异性等缺点。当然有些是可以避免的，解决的方法是对单链引物进行筛选，优化反应条件，但第一个缺点是无法避免的。如能把 RAPD与其它分子标 记如 RFLP、AFLP和微卫星等结合使用， RAPD仍将会发挥更好的用途

35、。总之，随着生物技术的不断发展和更多应用， RAPD技术也将更加完善，应用更加广泛。 3.2吉富罗非鱼雌雄群体遗传差异的 SSR分析 运用 SSR技术对吉富罗非鱼的雌、雄群体间的分子遗传结构及其变异进行了分析，结果显示，雌雄吉富罗非鱼群体的多态性位点比例、 PIC、基因多样性指数和 Shan。 non氏指数的值基本一致，表明国家级广西南宁罗非鱼良种场的 P8代吉富罗非鱼经过多代选育后雌、雄性群体的遗传差异已经很小。董在杰等 (2007)利用 RAPD技术对 奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的雌、雄群体间的分子遗传结构及其变异进行了分析，结果显示，雌雄奥利亚罗非鱼群体的多态性位点比例、基因多样性指数和

36、Shan non氏指数的值基本一致，与本研究中的结论相似。 4、研究进展和研究展望 4.1.1种群遗传多样性分析和种质资源的评估 在海水鱼类资源的开发与保护中 ,对鱼类种群的种质资源进行科学地评估十分重要。利用 DNA分子标记技术分析自然种群与人工养殖群体的遗传多样性和不同种属间或地理群体间的遗传差异 ,了解鱼类种群关系、进化地位 ,监测鱼群遗传渐渗和评估人工增殖放流效果等 ,这些都 有利于鱼类资源的保护、开发和利用。 孟宪红采用 RAPD技术对真鲷野生群体及人工繁殖群体进行了 DNA多态性检测 ,认为真鲷野生群体及人工繁殖群体的遗传多样性较为丰富 ,但人工繁殖群体的遗传多样性低于野生群体。王

37、志勇等利用 AFLP技术研究了我国沿海真鲷群体的遗传变异 ,结果显示 :北部湾群体的变异量最低 ,它与威海群体的遗传差异显著 ,两者明显属于相互独立的不同亚种群。 申雪艳等利用 RAPD和微卫星 2种分子标记技术分析了从法国、英国、西班牙引进我国的 3个大菱鲆群体的遗传结构。 McConnel S利用微卫星技术研究了加拿大 东海 5个大西洋鲑群体的遗传多样性和群体结构 . Nakabo等利用微卫星技术对东南亚海区鲈鱼进行分析 ,推翻了东亚地区只有 1种鲈鱼的说法。 蒙子宁等运用 RAPD 分析了采自黄海和东海 5个海区的小黄鱼的遗传多样性 ,从分子水平上支持了过去有关学者把黄海和东海的小黄鱼划

38、分为北、中、南 3 个地理群系的观点 . Perez2Enriquez等利用微卫星 3 个 DNA 位点分析了包括中国、日本和太平洋西南部 8个地点的真鲷 ( Pag rus m a jor ) 的遗传差异 ,证明太平洋北部与西南部的群体遗传差异明显。 Roques等 应用微卫星 DNA技术证明太平洋西北部的美洲平鲉 ( S ebastes fascia tus ) 和尖吻平鲉 ( S ebastes m en tella ) 存在基因渐渗现象。 Yu等。运用微卫星 6 个 DNA 位点验证了台湾沿岸的鳀鱼 ( Eng rau lis japon icus ) 分属 2个种群。 Masashi

39、等。利用 11个微卫星标记和 mtDNA对多个产卵地的牙鲆种群的遗传变异性进行了研究 ,结果表明 :每个取样地的牙鲆种群的遗传变异程度都有减小的趋势。 4.1.2分子系统发育和亲缘关系的分析 分子系统发 育 (Molecular phylogenetics)是指基于分子数据尤其是 DNA序列来研究有机体间的进化和亲缘关系。物种间亲缘关系的研究为确定育种方案、预测杂交优势提供了重要的理论依据 ,近年来 ,鱼类分子系统发育的研究取得了很大的进展。 Garrido2Ramos等用具有 EcoR酶切位点的中着丝粒微卫星 DNA家族序列对鲷科 ( Sparidae)各属间的系统发育关系进行了分析。 Oa

40、kiley等根据GHC (生长激素内含子 C)序列分析 ,认为大麻哈鱼属 (O ncorhynchus) 为单系 ,这与形态学和其他分子 数据 (包括核基因和线粒体基因 )一致 ,但不支持被广泛接受的大麻哈鱼属和大西洋鲑属 (S a lm o) 为姊妹属的看法 ,不过 ,他们认为这仍需进一步的研究来证实 ;同时 ,他们还认为基于 GHC序列的鲑科鱼类的分子系统发育关系是目前所有分子数据中最好的。 高天翔等对养殖褐牙鲆 ( Pa ra lich thys olivaceus) 的线粒体 DNACytb基因的部分序列进行了测定 ,认为由于褐牙鲆 Cytb基因具有高度同源性 ,因此研究其白化、黑化和

41、正常状态时出现的序列差异 ,对于研究褐牙鲆进化机理具有重要意义 . Avise等以mtDNA限制性长度多态性 (RFLP)技术分析了美洲鳗和欧洲鳗的产卵场 ,否定了过去一直认为它们具有混合产卵场的说法 . 江世贵等用 mtDNA扩增出细胞色素 b ( cytb)基因 ,对 4种鲷科鱼类进行了分类和系统进化研究 ,得出了与传统形态学分类不一样的结论 . Perez2En2riquez等根据分子差异分析建议将这一范围内的真鲷划为澳大利亚、新西兰和中国 - 日本 3 个种群 ,中国 - 日本种群又可分为中国南海、日本东南部和日本海峡 3 个亚种群。 4.1.3种类 (品种 )的鉴定 在鱼类育种过程中 ,准确地鉴定和筛选具有优良 遗传变异的个体是育种工作的前提 ,但鱼类个体标志、家系标志甚至群体和种类标志一直是难以解决的问题 ,而且有些遗传变异性是早期无法鉴定和筛选的 (如产卵量、品质、成熟期