1、毕业论文 文献综述 生物 技术 根霉原生质体融合技术及发酵特性研究 摘要： 原生质体广泛的应用于食品、制药、农业等领域，本文简略介绍了原生质体的制备、融合、再生及筛选的过程中的方法和影响因素，以及后代中关于发酵腐乳特性方面相关研究所需方法的简介。 关键词： 原生质体；融合； 微生物原生质体融合起源于 20 世纪 50 年代，经历了一个逐步改进和完善的过程，原生质体的融合方法： NaNO3、高钙高 pH 值、 PEG 法等， PEG 法师采用聚乙二醇为融合剂的一种化学方法，使用简便、经济、可重复性。根霉是一种丝状真菌，属毛霉科，是霉菌中一 种具有多酶系特征的霉菌，它除了部分泌淀粉酶外，还能分泌酸
2、性蛋白酶、酒化酶及乳酸、琥珀酸等多种有机酸和乙醇等。可以在整个发酵过程中始终边糖化边发酵连锁进行。根霉由于其内含丰富的淀粉酶、蛋白酶和其他酶类，常用在酿酒和制醋中分解淀粉及大豆加工中分解蛋白质。根霉分泌的胞外酶不仅种类多而且量大，从它的发酵上清液中可提取很多有用国内豆腐乳生产用的微生物除黑龙江克东豆乳腐使用的藤黄小球菌之外 1，其余所用菌均为丝状真菌 (如毛霉属、根霉属等 )，均具备以下特点：不产毒素，符合食品安全与卫生要求；菌丝体长且粗壮有力，有利于对 豆腐坯的包裹以保证豆腐乳的良好外形；培养条件粗放，生长快，便于管理：有较多的酶系 (如蛋白酶、肽酶、脂防酶 )，而且酶活较高，特别是蛋白酶类
3、，以利形成豆腐乳特有的质构与风味；生长适温宽，有利于常年生产。 1 原生质体融合技术 原生质体融合技术 (Protoplast Fusion)是将遗传性状不同的两个细胞融合为一个新细胞，使两亲株的整套基因相互重新组合的一种技术，是现代生化技术的一个分支。原生质体融合技术起源于 20 世纪 50年代，自 Weibull 利用溶菌酶首次得到巨大芽孢杆菌的原生质体后， Eddy 等利用蜗牛酶获得 酵母菌原生质体的报道也相继出现。随着原生质体融合技术不断的发展，相继出现了聚乙二醇 (PEG)法、电诱导法、电磁融合法、激光融合法等新技术，在提高了融合率的同时，也渐渐形成了一套系统的实验体系，亦成为微生物
4、遗传育种的新工具 2。 在众多新技术中，灭活原生质体融合是原生质体融合技术的重大发展。根据 “致死损伤互补 ”的机理，双亲灭活的原生质体如果发生融合，将能在再生培养基上生长形成融合新株。双亲灭活原生质体融合法不但可以省去亲株细胞的遗传标记，避免重组体失去亲本的优良性状，而且可以用不含例如抗生素等抑制细胞生长的 遗传标记物的培养基作为融合子选择培养基，从而可提高筛选效率 3。 1.1 原生质体的制备 制备原生质体，是进行原生质体融合的前提和基础，不同菌种细胞壁组成各不相同，所以制备原生质体最佳条件也存在着很大差异。在制备菌种原生质体时，曾采用过机械法脱壁，但原生质体制备数量有限而且容易使原生质体
5、受到损伤，不利于再生 4。目前主要使用酶法脱壁，绝大多数使用溶菌酶和蜗牛酶作为工具酶 5。由于酵母菌原生质体融合后的重组体融合子，容易发生回复突变，利用亲本菌株的单倍体细胞进行融合，能够有效地降低回复突变率，因此，酵母 菌原生质体制备一般取对数生长期的单倍体细胞，此时细胞代谢活跃，生长率高，群体细胞的化学组成形态及生理特征比较一致 6。 1.2 原生质体的再生 酶解去壁后的原生质体应具有再生能力，这是原生质体融合育种的必要条件，尽管原生质体具有生物活性。但它不是正常的细胞，在普通培养基平板上不能正常的生长、繁殖，必须加入渗透压稳定剂。影响原生质体再生的因素主要有菌种本身的再生特性原生质体的制备
6、条件和再生条件等。尤其是原生质体制备时的酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大 7。 1.3 原生质体的融合 原生质体融合有 两种情况：一种为自发融合，另一种为诱导融合。后一种通过人工诱导方法促使原生质体发生融合，其方法又可分为四种： (1)生物法是利用紫外线灭活的病毒膜片使细胞间产生凝聚和融合的方法，但考虑存在安全性及融合效率等因素，只适用于动物细胞融合； (2)化学法始于 20 世纪 70 年代，用化学融合剂促进原生质体融合，目前最常用的是聚乙二醇 (PEG)法； (3)物理法始于 20 世纪 80 年代前后，采用电场、磁场、激光、超声波等物理手段使亲本的原生质体发生融合，常使用的物理法
7、是电融合法；(4)混合法起源于物理融合法，包括细胞物理聚集电融合 法、细胞化学聚集电融合法、特异性电融合法等。它具有融合效率高、专一性强和对原生质体损伤小等优点，但存在方法和设备复杂等缺点 8。 1.4 融合子的筛选 原生质体融合后 ,真正的杂合二倍体是极少数的 .大多数异核体会产生亲型分离子。如何有效地筛选出具有优良性状的融合子是至关重要的，检出融合子的方法有多种，我们可根据实验目的和微生物不同加以选择，将介绍以下几种常用方法： (1)利用营养缺陷型标记筛选融合子，假设两亲株的的遗传标记为营养缺陷型 A+B-及 A-B+则其重组子的原养型为 A+B+，由于遗传互补 ,在高渗基本培养基 上能够
8、再生 ,从而能够筛选出融合子 .这是一种传统有效的方法，但营养缺陷型的获得繁琐费时，而且往往会造成亲本一些优良遗传性状的丢失。 (2)灭活供体法，亲本之一的原生质体经紫外线热或化学试剂等处理失活而作为遗传物质的供体，然后与另一亲本进行融合利用该方法可以省去一亲株的缺陷型制备，但融合率较低 ,周东坡，杨汝德，用这种方法成功地筛选出了融合子； (3)利用荧光染色法筛选融合子荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色素 (如DAPI， FTTC)标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融 合子，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合子 9。 2 根霉在大豆发酵食品中
9、的应用 大豆发酵食品是以大豆为主要原料，经过发酵制成的食品。而传统大豆发酵食品中主要利用的微生物有米曲霉、毛霉、根霉和细菌。其中，根酶能在高温条件下生长，其淀粉酶活力强，且分泌蛋白酶和脂肪酶的能力很强，因此用途也很多。 根霉型腐乳是用耐高温根霉来生产腐乳的。用于腐乳生产的根霉主要有米根霉、华根霉、少根根霉等。根霉与毛霉同属毛霉科，亲缘很近，形态相似，分泌酶系也类似。因此，这 2种微生物在腐乳中的作用相似。不同的是，毛霉生长温度偏 低、生产受季节性限制。少孢根霉是发酵腐乳的根霉属代表性菌株之一。全明海圈比较了雅致放射毛霉和少根根霉发酵生产腐乳的区别。少根根霉发酵的腐乳在 0h 12h时蛋白酶活增
10、长很慢，然后在 12h-48h时都保持较高的速率增长。从前进入盐腌阶段后，蛋白酶酶活降至最低，这说明高盐浓度条件下蛋白酶的酶活受到很大的抑制。由盐腌进入后酵阶段后，蛋白酶酶活有所回升，这与豆腐坯环境的盐度下降和水分上升有关。少根根霉发酵产生的脂肪酶活力高于雅致放射毛霉。有文献报道过工业脂肪酶的生产菌株是根霉属的，因此同属的少根根霉产脂肪酶活力较高是 合理的。在前酵结束时，少根根霉的脂肪酶酶活力比雅致放射毛霉高 17。在前酵阶段，少根根霉的糖化酶活在 0h-36h时快速增长，在 36h之后保持稳定，少根根霉比雅致放射毛霉有着更高的糖化酶活力，在前酵结束时酶活是雅致放射毛霉的 4倍。说明少根根霉比
11、雅致放射毛霉能更好地利用豆腐坯中的糖类，在代谢结果方面应该含有更多的糖类分解产物。在前酵阶段，少根根霉的 一葡萄糖苷酶酶活在前 24h时变化较小，在 24h-36h时快速增长，在 36h之后稍有下降。根据少根根霉比雅致放射毛霉具有更高 一葡萄糖苷酶酶活的结果推断，以少根根霉发 酵腐乳能使大豆异黄酮更快更彻底地转化为苷元形式，因此可能会比雅致放射毛霉具有更高的生理活性。 曹翠峰 10研究表明，少孢根霉可以用于夏季高温时腐乳的生产，克氏瓶扩大培养时选用半固体培养基 (在液体培养基中加入 1琼脂 )，温度 35 和相对湿度 94以上时毛坯长势最好，白坯接种量以 1： 7稀释量为最佳，由少孢根霉发酵成
12、熟的腐乳符合新产品、新口味的要求，但块型不够完整。少孢根霉氓 LU573具有较稳定的生产性能，在固体培养基上其最适生长条件是 40 ，培养基 Aw为 0.99，气体组成为空气。该菌种兼有耐高温、蛋白酶活力高 及生长迅速的优点。该少孢根霉在 30 40 时均能很好地生长，受温度变化影响较小。培养基为半固体时菌丝生长迅速，而温度降低，采用液体培养基时菌丝生长较慢。用该菌种发酵生产的腐乳样品质地疏松，入口细腻，咸淡适口，滋味鲜美，香气浓郁，符合消费者对新产品新口味的要求，具有一定的市场潜力，可用于腐乳酿制。只是若按传统工艺生产还需要解决豆腐块型不完整等问题。 3 展望 传统大豆发酵食品营养价值极高，
13、在我国已有上千年的历史，现在已普及到朝鲜、日本及东南亚等国家和地区，对亚洲人乃至整个世界的饮食生活和健康起到了很重要的促 进作用。 根霉作为发酵菌种之一，具有很高的应用价值。根霉和毛霉相比同属担子菌纲、藻状菌科，但生长温度比毛霉高，且小曲上的根霉，放置于通风干燥处保存， 35年后仍可照常使用。说明根霉孢子有极强的耐保存性。另外，根霉适应多种菌混合培养，具有一定的 “团结 ”性，这是根霉的一大优点。根霉、米曲霉、酵母菌三者在糯米上混合培养，培养器皿生长情况结果表明，根霉生长得最好。米曲霉在后期才能看到仅有少量菌丝出现。在糯米上培养的 3种混合菌中，根霉与米曲霉相比，处于绝对优势。酵母菌与根霉培养
14、、酵母菌与曲霉混合培养、三者混合培养结果 表明，众多菌类 “杂居 ”一起，根霉能坦然处之，并 “和平共处 ”，而且一枝独秀，在大曲中充当生力军 11。 目前，对传统发酵豆制品中的根霉的研究还不够深入，应进一步对其在发酵过程中的作用及变化进行研究；运用食品研究的新技术、新方法，对根霉进行分类及代谢产物研究，从而进一步挖掘我国丰富的菌种资源宝库，使传统大豆发酵食品走向世界。 4. 参考文献 1 Hopwood D A,Wright H M. Genetic recombination through protoplast fusion in StreptomycesJ.J Gen Microbio
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