1、毕业论文 文献综述 生物 技术 海藻酸二氧化硅杂化凝胶固定降解对苯二甲酸微生物的研究 摘要： 对苯二甲酸（ PTA）是一种重要的化工原料，其生产废水严重污染环境，对水生生物的生长繁殖造成了影响。近年来大多数研究者利用微生物降解对苯二甲酸废水，本文阐述了采用海藻酸二氧化硅杂化凝胶，固定该菌的固定化条件的优化以及其降解对苯二甲酸的动力学研究。 关键词： 海藻酸；二氧化硅；固定；对苯二甲酸；对苯二甲酸降解菌；动力学 1 引言 对苯二甲酸 (Pure Terephthalic Acid ,简称 PTA，又称 TA)是一种重要的石 油化工产品 ,是生产聚酯纤维涤纶、塑料增塑剂、农药和染料等化工产品的原料
2、或中间体 1。每1tPTA 的生产就会产生 34m3 的废水，其中 PTA 的含量高达 1500mg/L。 PTA 具有一定毒性 , 对水中微生物的再生有强抑制作用 2。该类废水如直接排入自然环境中，将对水中鱼及微生物的生长、代谢带来严重的危害 3。 众多研究表明 PTA 可以被利用微生物分解，并可作为微生物唯一的碳源被其降解。利用微生物降解对苯二甲酸（ PTA）可以解决由 PTA 引起的污染，不会浪费能量，节省资源，不会引起其他形式的污染。 2 对苯二甲酸 降解菌的研究现状 2.1 降解对苯二甲酸的微生物 数十年来，科学家一直在研究微生物对对苯二甲酸的降解。小岩成次等 4从土壤之中分离筛选得
3、到七株细菌，能以邻苯二甲酸、间苯二甲酸或对苯二甲酸做为唯一碳源的培养基中进行生长。其中三株为棒杆菌，两株为碱杆菌属，另外两株为节杆菌属。北京大学的林稚兰等 5从合成聚酯纤维涤纶工厂周围被对苯二甲酸粉尘污染的土壤中筛选出了 99 株细菌，其中 17 株经过 24h 的降解，能将初始浓度为 200mg/L 的对苯二甲酸溶液降解 90%以上。南京大学的邹惠仙等 6通过实验证明，从污泥中分离的 假单胞菌及土壤天然菌体能降解 PTA，并对这株假单胞菌对 PTA 的降解动力学研究，证明该菌的作用下， PTA 的降解速度符合 Michaelis-Menten 公式，并测定了最适合温度，最佳 pH以及不同温度
4、浓度的降解速度，求出了假平衡常数 Km以及各种温度的最大反应速度。 2.2 对苯二甲酸降解菌的实验室研究 用微生物降解对苯二甲酸一直是科技工作者的热门课题和难题，目前的研究成果很少，且均属于实验室阶段 7-12。大多数是通过分离筛选菌株的方法，证明某些细菌能降解 PTA。其中一部分的实验还涉及到细菌粗酶的提取，并对该菌 的酶进行酶促反应动力学进行了研究，张健飞等 13证明菌株提取酶的的 km 较小，说明对 PTA 的亲和力较强，适于对 PTA 的催化降解。官宝红等 14探究了对苯二甲酸降解菌的降解途径，证明 PTA可以分为好氧降解和厌氧降解途径。 2.3 海藻酸二氧化硅杂化凝胶 固定化细胞技术
5、在处理对苯二甲酸中的应用 固定化微生物细胞技术是利用物理或化学的手段将有利微生物细胞定位于现代的空间区域，并使其保持活性反复利用的方法 15。固定化微生物技术处理废水与传统的悬浮生物处理法相比，具有处理效率高、稳定性强、能利用不易形成絮凝体的微生 物和增殖速度慢的微生物、保持高效菌种、生物浓度高、耐冲击、污泥生成量少、固液分离效果好等特点 15。 在常用的固定化载体中，多糖类海藻酸 (Alginate,ALG)高分子水凝胶，和 sol-gel 二氧化硅 (SiO2)应用较为广泛。其中，海藻酸具有极好的生物相容性和很强的亲水性，海藻酸凝胶包埋过程操作简便，条件温和，且具有较大的孔径。同样， so
6、l-gel二氧化硅郭定华过程条件温和，机械强度好，稳定性强。然而由于海藻酸凝胶结构松散，细胞泄漏严重； sol-gel二氧化硅固定化过程的酸碱催化剂和醇类助溶剂对 细胞活性影响较大，因此如果将海藻酸的柔性和二氧化硅的刚性相结合，兼顾两种载体的优点，则有可能为细胞创造出更为适宜的微环境 16。 3 对苯二甲酸降解菌的培养与收集 3.1 培养基 用于分离纯化降解 PTA 细菌的培养基配方为： NH4Cl 1.0g/L， MgSO4 5H2O 0.25g/L， KH2PO4 3.0g/L， Na2HPO4 7g/L， NaCl 0.5g/L， PTA 1.0g/L，琼脂 15g/L， pH 7.01
7、7。这里采用此种培养基用于细菌的培养与保存，扩大化液体培养时，则不加琼脂。 3.1 斜面种子活化 取斜面保藏菌株接种于新鲜斜面， 30下恒温培养。 3.2 种子培养 取 1 2 环活化的斜面种子接入装有 100mL 基础培养基的 250mL 三角瓶中， 30，140r/min 的摇床振荡培养 24h。 3.3 增殖培养 以 1%的接种量将种子液接入装有 100mL 培养基的 250mL 三角瓶中， 30， 140r/min的摇床振荡培养 48h。 3.4 菌体浓度测定 采用 722 型可见分光光度计测定，波长 600nm，以相应增殖培养基为空白。 3.5 菌体的收集 在离心管中加入 30mL
8、培养液，在转速为 10000r/min 的条件下离心分离 10min，收集细胞。 3.6 降解率的测定 采用 WFZ UV-2008H 紫外可见分光光度计测定，波长 240nm，以蒸馏水为空白对照。将测得的数值带入到对苯二甲酸的标准曲线中，计算出培养基中对苯二甲酸的残留量。根据公式（降解率 =培养基中对苯二甲酸的配制浓度 -培养基中对苯二甲酸的残留量 /培养基中对苯二甲酸的配制浓度）计算出细菌的降解率。 4 细胞的固定 4.1 海藻酸凝胶固定化细胞 将干燥好的海藻酸溶解在蒸馏水中，浓度为 2.5%（ W/V）。 4ml 海藻酸溶液与装有100mL 培养基的 250mL 三角瓶内培养 48h 的
9、细胞离心，收集的细胞用 1ml 0.05M， pH 7.0 Tris-HCl 缓冲液混合均匀。将海藻酸和细胞的混合溶液用内径为 0.7mm 的 10ml 一次性医用注射器滴加到 20ml 0.2M CaCl2 溶液中。所形成的凝胶颗粒在室温下凝胶化 30mim后取出洗涤备用 16。 4.2 海藻酸二氧化硅 (ALG-SG)杂化凝胶固定化细胞 ALG-SG 杂化凝胶固定化细胞过程与海藻酸凝胶固定化细胞过程类似。首先将 二氧化硅胶体颗粒超声分散后，与溶解于 1ml 0.05M， pH 7.0 Tris-HCl缓冲液 的细胞混合 12h，使细胞充分吸附在二氧化硅胶体上。然后将上述细胞 -二氧化硅混合
10、液与 4ml浓度为 2.5%的海藻酸溶液混合均匀，用内径为 0.7mm 的 10ml 一次性医用注射 器滴加到 20ml 0.2M CaCl2 溶液中，在室温下老化 30min 后取出洗涤备用。 将二氧化硅的浓度自定义到每毫升海藻酸溶液中二氧化硅的掺杂量。 4.3 SiO2的掺杂量 对固定化材料性质的影响 将浓度（ W/V）为 0%、 0.5%、 1%、 1.5%、 2%、 2.5%、 3%的 SiO2掺杂入上述凝胶中，随机抽取其中 20 个凝胶颗粒，用压片法测定凝胶机械强度 ；采用电子显微镜查看颗粒内部；并用红外测定颗粒表面积。 5 微生物降解对苯二甲酸的动力学研究 5.1 不同 pH 对
11、TA 降解率的影响 pH 分别为 6、 7、 8、 9、 10，浓度为 0.1g/L 的 TA 溶液，设平行试验 测定 pH 对微生物降解 对苯二甲酸的速度的影响，同时得到最佳 pH 范围。 5.2 不同 温度对 TA 降解率的影响 TA 浓度均为 0.1g/L，接种量相同，设平行及对照试验。共分七组置于 4、 10、20、 30、 33、 35、 40温度下培育，以测定温度对微生物降解 TA 速度的影响，同时得到最适温度。 5.3 不同 接种菌量对 TA 降解率的影响 TA 浓度均为 0.1g/L，取 12 瓶装有 100ml 培养液的 250ml 锥形瓶，接种相同菌液，培养 48h，离心，
12、收集细胞，以 1/12 份细胞为一个单位，分别包埋 1/4、 1/2、 3/4、 1、3/2、 2 个单位的细胞，同时游离细胞设置对照，以测定接种菌量对微生物降解 TA 的影响。 5.4 各种温度下， TA 初始浓度对微生物降解 TA 的影响 接种量相同，培养温度为 4、 10、 20、 30、 33，初始浓度分别为 50、 100、200、 400、 600、 1000mg/L，做平行试验及对照，测定 各种温度下， TA 初始浓 度对微生物降解 TA 的影响。 5.5 分析方法 间隔一定时间，自底物中取样，以 4000r/min 离心 20min，取上层清液，稀释一定倍数，在 240nm波长
13、下，以底物为空白对照，测定吸光度，求出 TA 浓度。 参考文献 1 钟治晖 , 鲁鹏 , 程树培 , 等 . 降解精 对苯二 甲酸生 产废水特 化菌株 性能测 定 J. 南京大学报 ,2000,36(3):312. 2 章杰 .染料和助剂工业中的环境荷尔蒙间题 J.化工进展 ,2001,4(1):21-23,141. 3 Kleerebezem R,Hulshoff Pol L W, Lettinga G. The role of benzaoate in anaerobic degradation of terephthalate J.Applied and Environmental Mi
14、crobiology,1999,65(3):1161-1167. 4 小岩成次 ,五十岚辰夫 .土壤中的细菌降解对 ,间 ,邻苯二甲酸 J.发酵技术 ,1979,55(2):97-10 2. 5 林稚兰 .应用生物降解处理石油化工废水 J.环境化学 ,1986,4(1):7-12. 6 邹惠仙 .微生物降解对苯二甲酸的动力学研究 J.科学通报 ,1983,22(8):1374-1377. 7 刘桂春 ,王文科 ,孙淑华 .聚酯纤维的表面改性与染色 J.聚酯工业 ,1998,11(3):17-22. 8 张健飞 ,王晓春 ,巩继贤 ,等 .微生物对涤纶丝及合成单体的降解初探 J.纺织学报 , 2
15、003,24(3):58-61. 9 Zhang Jianfei,Wang Xiaohun,Gong Jixian,et al.A study on biodegradability of PET fiber and diethylene glycol terephthalateJ.Journal of Applied Polymer Science,2004,93(3):1089-1096. 10 Torsten Walter, Josef Augusta, Rolf-Joachim,et al.Enzymatic degradation of a model polyester by li
16、pase form Rhizopus delemarJ.Enzyme And Microbial Technology,1995,5(4):218. 11 Thierry Lalot,Maryvonne Brigodiot.Emest Marechal.Enzymic hydrolysis of phthalic unit con -taining copolyesters as a potential tool for lock length determinationJ.Polymer Degradation And Stability,1998,6(11):409-415. 12 Koh
17、ei Oda.Method for decomposing polyesters containing aromatic moieties,a denier red -uction method of fiber,and microorganisms having activity of decomposing the polye- ster J.Textile Technology,2002,6(237): 213. 13 张健飞 ,刘中君 .对苯二甲酸及聚酯膜生物降解 J.天津大学学 报 ,2006,6(S1):324-328. 14 官宝红 ,徐根良 ,章亭洲 ,等 .微生物降解对苯二甲酸 J.浙江大学报 ,2002,8(22):114-118. 15 曹亚莉 ,田沈 ,赵军，钱城 ,杨秀山 J.微生物学通报 ,2003,30(3):77-81. 16 许松伟 ,姜忠义 .海藻酸 -二氧化硅杂化凝胶固定化脱氢酶研究 D.天津 :天津大学化工学院 ,2005. 17 刘中君 .对苯二甲酸 TA 及涤纶 PET 膜的生物降解研究 D.天津工业大学学位论文 ,2005: 3-17.
