1、毕业论文 文献综述 生物 技术 微生物原生质体研究方法概述 摘要： 原生质体融合不但可以进行遗传育种研究 1，而且也能获得菌种融合体和重组体的有效方法。但亲本遗传诱变筛选较麻烦，也会造成一些突变。利用灭活原生质体进行融合是近年来选育曲霉的重要手段 2。本实验选用生长速度快但蛋白酶活性低的根霉菌株和生长速度慢但蛋白酶活性高的根霉霉菌株组分别通过热及紫外对亲本原生质体灭活后融合 3，筛选出生长速度快且产蛋白酶活性高的新菌株。 关键词： 菌种选育 ； 聚乙烯醇 ； 降解 ； 1 前言 聚乙烯醇是水溶性有机大分子化合物 ,是用量 较大的纺织工业退浆液。 PVA 是难以被生物降解 ,其分子的化学性质稳定
2、 ,在印染工序中都是常常以退浆废水的形式排入江河 ,并在附近的环境中循序积累 ,使被污染的水体表面泡沫增多 ,粘度加大 ,影响好氧微生物的活动 ,对水体的性能及水体的复氧极为不利。许多行业还把整个 PVA用作胶料、乳化剂、保护胶、增厚剂、稳定剂等的用途。国内外从 20世纪 70年代开始通过物化法和生化法的处理方法对 PVA废水的治理进行了研究。处理那些组分不但单一而且 PVA浓度很高的废水时物化法才有价值 .但是在通常的情形下 , PVA废水成分却是比较的复杂 ,PVA浓度反而是相对的较低 ,水量较大 ,对于所谓的材料、设备和处理成本 ,都不可以运用用该项技术进行处理 .所以现在会让人干兴趣的
3、事采用生化的方法处理这些相对比较低浓度的PVA废水。废水中 PVA所包含的生化需氧量很低 ,印染废水中含有大量 PVA，并且 BOD5化学需氧量一般来说都小于 30%,还有其生化性也是差的 .根据以前的理论微生物不能降解 PVA. 但 1973 年 Suzuki 居然从土壤中分离到 1 株能产生一种 PVA 降解酶的假单胞菌 , 还有此酶可以氧化和切断 PVA分子 .从后来大量的研究结果看出 ,酶生物降解 PVA是可行的 ,最主要 筛选高效降解菌的科学工作者可以容易的从废水中筛选分离得到能用于高效处理的菌株 ,随后把此高效菌株用生物方法进行原生质体融合 4,实现基因重组 ,从而这些融合子的各种
4、性状可以经过互相弥补而得到改良 ,则提高其对 PVA降解的能力。 2 方法 2.1 原生质体融合的制备过程 在液体完全培养基接种单倍的体细胞并使其活化 !随后通过离心机离心得到菌体 !将菌体悬浮于乙二胺四乙酸或巯基乙醇中 !振荡试管经过一段时间处理 !从而使菌体里的细胞壁中所含的交联键松动 !从而增加对酶的敏感性 !接着通过离心机离心得到菌体 !在离心管中加入一定量 的高渗酶液酶解 !则这些菌体去壁程度开始越来越完全 !其外在的表现形式为原生质体形成率渐渐变高 !当过了一段时间后 !通过上述的处理后，差不多全部的细胞已经形成原生质体 !所以不用再进行酶解，因为如果再进行酶解的话会使原生质体的质
5、膜受到很大的破坏 !导致原生质体失去活性 !使这些菌体再生率明显下降 !所以最好要选择最合适的酶降解的时间 2.2 原生质体融合所得融合子的筛选方法 用接种针小心挑出融合菌株体，接种到高压灭菌过的马铃薯培养基上 5。将融合过的菌落的孢子用溶液稀释到一定程度后接种到高压灭菌过的酪素平板上，在 28 的环境下培养 72h，然后测定该菌株的透明圈直径与菌落直径的比值 (Hc)，通过 Hc 值的对比来衡量各个菌株蛋白酶活力的高低 6。 2.2.1 利用营养缺陷型作为遗传标记 这是一种 非常的传统有效的 选择标记方法， 这个方法的 检出设计的原则是将亲本菌株诱变处理后产生对某些营养物质合成途径受阻的突变
6、株，在 这些 分离的培养基上 ，我们可以发现 融合子生长 状况良好，而 突变的双亲本原生质体 却没有 形成菌落。融合的双亲 都是 带有不 一样的 营养缺陷型标记 7， 检出融合子的方法 是将 原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上 8。 这个 原理是因为 含有 缺 陷型的 这两个 亲 本 失 去 了合成某 种 营养物质的能力， 所以 它们 不能 在 这些 基本培养基上生长、 繁衍生殖 ， 而且 同一个 亲本融合 的 原生质体也不 可以 在 这些 基本 的 培养基上 生长、繁殖 ，只有 经过 不 一样 亲本原生质体 进行 融合后 9，缺陷的营养物质 进而 得到 互相弥补，这样野生型才
7、能恢复在基本培养基上萌发生长形成菌落 的能力 。 2.2.2 利用抗药性标记筛选融合子 每个菌种都有微生物的抗药的重要特性 ， 这 是 完全 由遗传物质决定的，对某一种药物的抗性不 一样 的微生物 都有 存在差异， 通过 这种 明显的 差异 就能 对融合子进行选择10。比较灵敏 、快速的抗药性标记筛选融合子法 就是 在秸秆的生物降解中选育高效的菌种 11。 2.2.3 利用荧光染色法筛选融合子 荧光染色法是 预先 使双亲 经过 染色而携带不 一样的 荧光色素 的 标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下 12， 用工具 挑取带有双亲原生质体荧光标记的融合子 13， 然后 直接将其 分离到再生培养基
8、上 进行 再生， 过一段时间可以 得到融合子。日本、法国先后采用荧光染色法在酵母菌、担子菌原生质体融合中 检出融合子 14。 本法简 单方便容易操作 ， 它不但 保持了亲本的优良遗传特性， 而且必然 是融合子选择法的发展趋势 15， 然而他 对仪器设备 的 要求 相对较 高， 而 且费用 相对较 高， 对于 有条件的实验室 ，他们就可以 采用此法能提高融合效率。 原生质体融合所得融合子的筛选方法还有很多方法，比如 通过利用 灭活原生质体标记筛选融合子、双亲对碳源利用不同检出融合子、对昆虫的毒力测定进行融合子的选择、生化 的 测定指标选择融合子。 3 原生质体的再生 判断 融合后的原生质体能不能
9、很好的传代，就 可以观察其 能不能长出细胞壁。影响原生质体再生 的因素 有很多， 例如 培养基的种类、渗透压等。 因此 选着合适的培养基 就可能决定 原生质体再生 能否长出细胞壁 。 参考文献 1 Hopwood. Genetic recombinationJ.生物技术通报 ,1987,25(7):456-471 2 梁平彦 ,刘宏迪 .展青霉和产黄青霉的种间体细胞杂交 J.微生物学报 ,1982,22(3):248-256. 3 彭帮柱 ,岳田利 ,袁亚宏等 .酵母原生质体融合技术 J.西北农业学报 ,2004,13(1):101-103. 4 王燕 .热 -紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲
10、霉菌株研究 J.中国酿造 ,2008,19(11):42-44. 5 李立风 .几株同源酱油曲霉的多亲株电融合 育种 J.中国调味品 ,2007,7(3):14-18. 6 芦志龙 .基因组改组及在微生物育种中应用研究 J.生物技术通报 ,2008, 17(5):15-19. 7 王国良 .对小猿叶甲高毒力烟曲霉菌株的选育技术 J.中国生物防治 ,2008,24(2):182-185. 8 辛明秀 ,蒋亚平 .米曲霉原生质体融合 J.微生物学通报 ,1994,21(3):143-147. 9 邢来君 .米曲霉原生质体营养互补融合 J.真菌学报 ,1989,8(3):227-232. 10 王燕
11、 .米曲霉原生质 体融合中原生质体制备的研究 J.中国酿造 ,2007,9(5):19-22. 11 唐洁 .紫外灭活原生质体融合选育米曲霉菌株的研究 J.食品工业科技 ,2006,3(8):66-70. 12 许晓妍 ,崔承彬 .黑曲霉原生质体互补融合 J.微生物学通报 ,2001,19(7):67-68. 13 林峻 .几株同源米曲霉的多亲株电融合育种 J.生物工程学报 ,2003,25(1):243-255. 14 徐波 ,王明蓉 .酵母原生质体融合的应用 J.中国抗生素杂志 ,1987,22(2):257-270. 15 林祖申 .提高企业经济效益 J.西北农业学报 ,2005,11(5):67-68.
