1、毕业论文 文献综述 生物 技术 原生质体融合技术研究概述 摘要 ： 原生质体融合技术是将遗传性状不同的两个细胞融合为一个新细胞，使两亲株的整套基因相互重新组合的一种技术，属于细胞工程是现代生化技术的一个分支。在 1980年举行的第六次国际发酵讨论会上，原生质体融合技术是大会讨论的主要内容之一，认为通过原生质体融合进行基因重组的研究已经成为微生物遗传育种的一种有效的新工具 1。国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟，一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生，电融合技术是利用直流或交流电场的作用， 迫使两亲本原生质体融合，原生质体的融合以及融合子的筛选等。 关键字 ： 原生质
2、体；融合技术应用；制备工艺 1 前言 1.1 研究现状与应用 随着原生质体融合技术的不断进步创新，其广泛的作用已运用至微生物育种，植物原生质体融合。 自从 1971年报道从烟草原生质体再生植株以来。至今已有 46科 160多属360多种植物 （ 包括亚种、变种 ） 的原生质体成功地获得了再生植株。原生质体融合是进行遗传育种研究的重要手段，也是获得菌种融合体和重组体的有效方法。但是亲本菌株遗传标记的诱变筛选较费时费力，而且会带来一些不良突变利用灭活原生 质体作为供体进行融合是近年来选育曲霉的重要方向 2。原生质体在植物生理学中主要应用在原生质体膜、细胞壁的再生、微管与细胞分裂、内吞作用和液泡、气
3、孔生理、超低温保存、原生质体摄人细胞器等方面。原生质体在病毒分子生物学中为研究病毒浸染、复制、基因组功能、病毒与寄主细胞的相互作用等提供了强有力的手段 3。 苹果是果树中原生质体分离及培养研究较早的树种，起源于 80年代 . 至今大致经历了三个阶段：第一阶段主要侧重于分离原生质体进行生理生化方面的研究 4-6。第二阶段是由不同的材料分离出原生质体并有愈伤组织的形成 ，但无再生植株的报道；自 1983年 PATA-OCHATT7首次报道获得苹果叶肉原生质体再生植株后，又一些苹果原生质体再生成株的报道 8；至今已有 14个苹果基因型的原生质体经培养获得再生植株 9。此阶段是苹果原生质体培养再生的突
4、破阶段，但成功的基因较少，原生质体来源也较有限；目前苹果原生质体研究进入了一个攻关的阶段。随着生物技术领域相关技术的成熟和研究手段的改进，通过研究工作者的不懈努力，苹果原生质体技术的应用有望成为现实。 1979年匈牙利的 Pesti首先提出了融合育种提高青霉素产量的报告 10， 开创了原生质体融合技术实际工作中的应用，使原生质体融合技术成为了工业菌株改良的重要手段之一。 Hopwood11等提出，原生质体融合重组可能实现隐形基因的重组暴露，产生新基因表达隐性的记忆，从而使成为链霉菌抗生素产生菌种的新途径。 利用微生物处理污水是一个很有效的方法 ， 许燕滨 12等采用原生质体融合技术构建一株高效
5、的降解含氯有机物工程菌，应用于造纸漂白废水。程树培 13等由单亲株灭活获得酿酒酵母与热带假丝酵母原生质体融合而成的杂交酵母细胞，净化味精废水，提高净水效率。 2 原生质体融合技术 原生质体融 合技术是将遗传性状不同的两个细胞融合为一个新细胞，通过原生质体融合技术使两个菌株的遗传物质得到重组，从而得到兼具两个亲本优良性状的新菌株14。利用原生质体融合技术不但可用于提高抗生素的产量，同时还可用于融合子产生新抗生素的研究，特别是链霉菌育种中 15。 2.1原生质体融合制备过程 植物的细胞融合主要由下列四步骤： （ 1） 原生质体培养：将悬浮培养的细胞利用纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶等将植物细胞壁分解
6、，形成原生质体。 （ 2）融合：离子诱导融合法 ： Carlson等 （ 1972） 采用 NaNO3溶液融合法获得 第一个植物体细胞杂种植株。 Kellers&Melchers 利用高钙离子 、 高 pH 进行烟草品种间原生质体融合。聚乙二醇（ PEG）法：在高钙浓度、 pH9-10及 PEG 存在下促使原生质体融合。电融合法：利用高频脉冲电流，使质膜瞬间穿孔，与相邻的原生质体连接、闭合，产生融合细胞。 （ 3）细胞培养与杂种细胞筛选：融合产生的细胞包括同核体、异核体和多核体等不同的类型。还需要通过培养筛选有用的杂种细胞，因杂种细胞在形态、密度和亲代原生质体不同，可利用显微镜观察或密度梯度离
7、心法分离，也可以更具营养缺陷或抗药性等方法进行筛选 。 （ 4）诱导完整植株，融合后的原生质体经培养后会再形成细胞壁，形成愈伤组织，培养成植株。 微生物原生质体制备融合的整个过程包括 16： （ 1）原生质体制备培养：将培养好的菌丝体培养液用四层擦镜纸过滤，根据离心管大小装入一定量的菌丝体到已灭菌的离心管中，以 1400转每分钟的低转速离心 10min。之后去除上清液。然后将沉淀移入另一个已经称量过的灭过菌的离心管内，封好进行称量。加入混合酶液后将菌丝和酶液充分混匀，放入适当的温度、转速为 100rad/min的摇床中酶解一定的时间。酶解完成之后将混合 液用四层擦镜纸（已紫外灭菌）过滤，接着将
8、滤液装入 EP 管（已灭菌）以 6000转每分钟的转速离心 20min。之后取少许上清液在显微镜下进行观察，如没有原生质体说明原生质体已经完全沉淀了。此时可以将上清液去除，然后用渗透压稳定剂悬浮原生质体。 （ 2）融合方法： 化学融合法（ PEG融合）；电融合法：电融合技术是利用直流或交流电场的作用，迫使两亲本原生质体融合；激光诱导融合法：利用激光束对相邻两个细胞接触区的原生质膜进行穿孔，使两个细胞的基因进行交换重组，目前利用这种方法诱导动植物细胞的原生质体融合已有大量报道，但用于 酵母菌原生质体融合报道较少。 2.2 原生质体融合所得融合子的筛选方法 原生质体融合后真正的杂合二倍体是极少数的
9、，大多数异核体会产生亲型分离子，如何有效地筛选出具有优良性状的融合子是至关重要的。 2.2.1 利用营养缺陷型作为遗传标记 这是一种常见而有效的传统的选择标记方法，其检出设计的原则是将亲本菌株诱变处理后产生对某些营养物质合成途径受阻的突变株，在分离的培养基上只有融合子生长而不能让突变的双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出 融合子。其原理是因为缺陷型的双亲由于丧失了合成某种营养物质的能力，它们在基本培养基上不能生长、繁殖，同一亲本原生质体融合也不能在基本培养基上形成菌落，只有不同亲本原生质体融合后，缺陷的营养物质得到互
10、补能恢复为野生型在基本培养基上萌发生长形成菌落。 2.2.2 利用抗药性标记筛选融合子 微生物的抗药性是菌种的重要特性，是由遗传物质决定的，不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异，利用这种差异即可对融合子进行选择。在对秸秆的生物降解中选育高效的菌种就是用相对比较灵敏 ， 快速的抗药性标记筛选融合子法。 2.2.3 利用荧光染色法筛选融合子 荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合子，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合子。日本、法国先后在酵母菌、担子菌原生质体融合中对融合子的检出采用了荧光染色法。本法简便易行
11、，保持了亲本的优良遗传特性，是融合子选择法的发展趋势，但对仪器设备要求高，且费用也高，有条件的实验室采用此法能提高融合效率。还有很多方法，比如利用灭活原生质体标记筛选融合子 ， 双亲对碳源利用不同而检出融合子 ， 对昆虫的毒力测定进行融合 子的选择 ， 生化测定指标选择融合子。 3 原生质体的再生 原生质体再生：将所得原生质体悬浮液用 0.8mol LNaCI溶液梯度稀释至适当浓度后取 lmL分别接种于 CM平板和高渗 CM平板，用公式 （ 1） 计算再生率：再生率 （ ） =（高渗 CM平板菌落数 CM平板菌落数） /显微镜计数原生质体数（ 100） 17。 参考文献 1 彭帮柱 ,岳田利
12、,袁亚宏等 .酵母菌原生质体融合技术 J.西北农业学报 ,2004,13(1):101-103. 2 王燕 .热紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究 J.中国酿造 ,2008,19(7):42-44. 3 张颖 ,张微微 ,王芳 .植物原生质体研究概况 J.安徽农业科学 ,2010,38(8):3941-3943. 4 Matto A,Libarion M,Location of the ethylene-synthesis system in apple tissue J.Plant physical,1977,60(5):794-799. 5 Barbier M,Bessis R
13、.Isolation and culture of Grapevine cv.chardonnay leaf protoplastJ.Euphytica,1990,47(5):39-44. 6 LISE K,KWAKKENBOS A M,VEEN H. Differential effects of silver salts in apple tissue,Malusdomestic silver nitrate.silver thiousuulfate,ethylene production from xorten cylinders viability of protoplasts inh
14、ibition of metabolismJ.Plant Science Letters,1984,33(1):1-6. 7 PATAT-OCATT E M,OCHATT S J,POWER J B.Plant regeneration from protoplasts of apple rootstocks and varieties (Malus domesa Bork h.) J.Plant physial,1988,133:460-465. 8 潘增光 ,邓秀新 .苹果 原生质体研究进展 J.园艺学报 ,1997,24(3):239-243. 9 王旭静 .苹果砧木原生质体分离技术研究
15、 J.河北农业大学 ,2000,17(2):45-47. 10 Pesti M,Konszky E,Polga J, er al. Fifth international protoplast symposiumJ. Plant physical,1979,24(3):54. 11 Hopwood D A,Wright H M, Bill M J et al.Genetic recombination throttgh protoplast fusion in streptemycesJ. Nature,1977,268(8):171-173. 12 许燕滨 , 江霞 . 高效含氯有机物化合物
16、降解工程菌的构建研究 J. 重庆环境科学 ,2001,23(2):46-48,51. 13 程树培 ,邓良伟 .光合细菌与酵母原生质体融合子连续发酵豆制品废水研究 J.环境科学学报 ,1997, 17(3):372-377. 14 谭周进 ,杨海君 ,林曙 ,吴铁 .利用原生质体融合技术选育微生物菌 种 J.核农学报 .2005,19(1):75-79. 15 RICHARD H. BALT Z.Genetic Recombination by Protoplast Fusion in Streptomyce.Journal of Industrial Mincrohiology Biotec
17、hnology,2001,22(4-5):460-471. 16 Muralidhar R V,Panda T.Fungal protoplast fusion-a revisit. EngineeringJ.2000,22:429-431. 17 陈合 ,胡云红 ,秦俊哲等 .灵芝菌原生质体融合条件研究食品科学 ,2007,28(2):173-176. 18 李晓霞 ,邱玉玉 ,柴同杰等 .两种兔源肠致病性菌原生质体融合的耐药性遗传标记选择 J.家畜生态学报 ,2006,27(6):59-62. 19 刘玲 ,叶博 , 刘长江 .原生质体融合亲本菌株抗药性标记的筛选 J. 江苏农业学报 ,2007,22(3):225-227. 20 成亚利 ,朱宝成 .荧光标记金针菇原生质体融合 J.微生物学通报 ,1997,24(6):331-333. 21 王春平 ,韦强 ,鲍国连 ,刘燕 ,邵泽香 ,季权安 .微生物原生质体融合技术研究进展 J.动物医学进展 ,2008,29(5):64-67.
