1、毕业论文 文献综述 生物 技术 禽呼肠孤病毒形态的早期步骤 摘要： 禽呼肠孤病毒是主要的病原体，可能导致家禽养殖中巨大的经济损失。它们的基因组至少表达了八种结构蛋白和四种非结构蛋白，其中三种是由 S1基因编码的。这些病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞，病毒包含的内涵体的酸化对病毒的脱壳和释放转录活跃的核心到细胞质是必需的。禽呼肠孤病毒的复制在被称为病毒工厂的球形形态的细胞内含物中进行，它与微管无关，是由非结构蛋白 NS形成的。这种蛋白也介导一些病毒蛋白（但有些则没有）与内含物的结合，这表明病毒蛋白的招募进入禽呼肠孤病毒工厂是具有特异性的。禽呼肠孤病毒的形态是一个复杂的过程和时间控制的只发生在感
2、染细胞的病毒工厂内。核心装配发生在它们蛋白部件合成之后的最初 30分钟里，完全形成核心然后包覆外层衣壳蛋白多肽，在下一个 30分钟将产生成熟的传染性的新病毒颗粒。根据从禽呼肠孤病毒的数据和呼肠孤病毒科家族的其它成员所报道的结果的研究，我们提出了一个关于禽呼肠孤病毒基因表达和形态发生的模型。 关键词： 呼肠孤病毒；病毒工厂；非结构蛋白 NS 禽流感和哺乳动物的呼肠孤病毒组成了 正呼肠孤病毒属两个主要的种群，是呼肠孤病毒科家族 12个成员之一 1。虽然这些呼肠孤病毒在结构和分子组成上非常相似 2,3，但是这两个组群的成员在宿主范围、致病性的程度和基因编码能力方面存在不同，在病毒的生化特性方面也不同
3、 4。只有禽呼肠孤病毒诱导感染细胞中合胞体的形成，而只有哺乳动物呼肠孤病毒能诱导红细胞凝集 5,6。 鸟类的呼肠孤病毒在禽类中很普及，但是其传染性通常是无症状的，并且从鸟中分离出来的大多数呼肠孤病毒是非致病性的。在病毒和疾病之间的直接联系存在的仅仅是最后才表明患有病毒性关节炎综合症和腱鞘炎，通过踝 关节连接处的肿胀和腓肠肌筋的病变特征表现出来 7,8。根据对细胞附着蛋白 C的序列系统发育分析，编码禽呼肠孤病毒组有五种不同的基因簇。然而，在特定的基因型和疾病症状中分离出来的病毒之间没有相关性可以被建立 9。而且，到目前为止，所有按照病毒血清学特征把禽呼肠孤病毒进行分类的尝试都没有成功。因为这些病
4、毒显示了高度的抗原异质性，而在中和测试中表现出相当大的交叉效应。 禽呼肠孤病毒拥有由十段双链 RNA组成的基因组包裹在二十面体对称的无包被双层蛋白衣壳之中。至少有十种不同的结构多肽存在于禽呼肠孤病毒中，它们分布于病毒颗粒里如图 1所展现 10,11。 禽呼肠孤病毒的结构蛋白在电泳迁移率的反向顺序中已经按字母顺序排列标分配 (A, B, etc.)，用于区分来自哺乳动物呼肠孤病毒蛋白分配的数值标 (1, 2, etc.)。 初始病毒细胞外的附件对于寄主细胞是通过迄今为止还未知的寄主受体，较小的外衣壳蛋白 C的具体作用来调节的 12,13。禽呼肠孤病毒通过受体调解内吞作用进入宿主细胞（图 2），并
5、且病毒含有的内涵体的酸化对禽呼肠孤病毒在感染细胞中的脱壳和复制是必需的 14,15。病毒的脱壳被认为便于膜的相互作用，对释放有能力转录的禽呼肠孤病毒核心进入细 胞质是必需的。 图 .1A-C 禽呼肠孤病毒 S1133基因组片段（ A）和原始转录产物（ B）的电泳分析。 .哺乳动物呼肠孤病毒同源多肽用数值命名法在括号内被表示。 C 处是禽呼肠孤病毒的图解，指出了结构多肽的位置。 图 .2 电子显微镜显示了禽呼肠孤病毒渗透进入禽细胞的过程。把纯化的禽呼肠孤病毒添加到鸡胚单层培养的成纤维细胞内，在 4 下孵化 1小时，接着将细胞放在 37 下孵化一段时间显示在上面，经固定后在电子显微镜下观察分析。
6、细胞内病毒的转录是被一个核心结合的双链 RNA依赖的 RNA聚合酶所催化，产生病毒 mRNA与它们编码基因的正链相同，在 5丿 端具有类型 1的帽子结构，缺少 3丿 的 Poly（ A）尾巴 16。呼肠孤病毒的 mRNA在感染细胞中发挥着双重作用，它们在核糖体上进行着病毒蛋白的合成，并且与它有联系的负链的产生作为模板，因此产生后代双链 RNA基因组片段。每一个禽呼肠孤病毒的多肽是由相同的基因所编码的，在体外的翻译是由单个基因组片段变性所决定的 (图 .1)。虽然大多数禽流感呼肠孤病毒基因组片段以单顺反子出现，在感染细胞内 S1片段 三顺反子 基因的功能是表达两种非结构蛋白 (p10 和 p17
7、)和一种结构蛋白 (C) (图 .1)17。两种其他的非结构蛋白 NS和 NS是由 M3和 S4基因组片段分别编码的，一个氨基酸改变了 NS的亚型，被称为 NSC，最近表明在禽呼肠孤病毒感染细胞中产生 18。 禽呼肠孤病毒 M2 基因的主要翻译产物是 B蛋白，在细胞内被十四烷酰化，蛋白酶解。 B的特定位点的分裂产生一个十四烷基的 N-末端肽 BN 和一个巨大的 C-末端蛋白 BC，两者的前体和分裂产物是呼肠孤病毒的结构组成 19。最近表明，非结构蛋白P10的棕榈酰化以胱氨酸模式保存在膜近端，并且这种共价修饰的出现对于这种蛋白的膜融合活动是 必需的 20。所有禽呼肠孤病毒感染细胞的蛋白，除了 A
8、之外可能是 B 出现了糖基化，虽然发生的糖基化程度很低。 1. 病毒性工厂 关于呼肠孤病毒科家族的不同成员一定数量的早期研究结果显示，这些在细胞质内复制和装配的阶段凝集成不等的内含物被称为病内含物、病毒工厂或者病毒形成圈。这些特定的结构包括结构蛋白和非结构蛋白，也包括病毒双链 RNA和部分或全部装配的病毒颗粒，但是缺少膜和细胞器，包括核糖体。它们首先是以许多小颗粒遍布分散出现在在细胞质，当进一步侵染时，它们变大，数量减少，核周分布 21-23。呼肠孤病毒工厂 的成因和组成，也在病毒生活周期中它们起作用，只是刚开始被鉴定。 感染禽呼肠孤病毒的细胞同样被发现包含大量的细胞质阶段凝集内含物位于病毒复
9、制和装配的位点 24,25。大量的核周内含物的次晶排列主要包含完整的病毒和空载的病毒颗粒，在禽呼肠孤病毒感染细胞的超薄切片的电子显微镜下观察到。感染细胞和免疫荧光电镜分析进一步显示了禽呼肠孤病毒工厂是球状形态的离散结构，没有微管相连18。在感染期间，球形工厂同样产生类型 3的哺乳动物呼肠孤病毒种系 T3DN 和 T3C1226。相比大多数哺乳动物呼肠孤病毒种系 形成的微管结合工厂，其丝状特性的出现是由核心蛋白 2的容量所决定的，并与微管相互作用，一起锚定于病毒工厂 27。这些结果表明，像哺乳动物呼肠孤病毒 T3DN 和 T3C12所对应的 2一样，禽呼肠孤病毒 A并没有与丝状微管结合，虽然这个
10、假说和假定 ANS的联系有待实验证实。 一些禽呼肠孤病毒蛋白在侵染细胞内的分布与转导细胞的对比分析表明，虽然所有这些蛋白都出现在侵染细胞的病毒工厂内，而在转导细胞内单独表达时只有 M3编码的非结构蛋白 NS位于细胞质球形内含物内 (图 . 3, panel 1A)。这个 结果表明 NS是最小的病毒因子需要在感染细胞的工厂里形成，工厂的矩阵是 NS的主要组成部分。像禽呼肠孤病毒蛋白 NS，呼肠孤病毒科家族的其它成员的一些非结构蛋白也被报道说在缺少其他病毒部件时能诱导病毒形成圈样结构的形成。例如：在细胞侵染时，病毒内含物的形成与重组杆状病毒表达蓝舌病毒非结构蛋白 NS，并且在细胞中与轮状病毒的非结
11、构蛋白 NSP5和 NSP2的共转移或与哺乳动物呼肠孤病毒蛋白 NS的转移有关 28 ,29。 禽呼肠孤病毒 NS的包涵体形成的能力表明通过启动病毒复制的位点，这些蛋白在禽呼肠 孤病毒生活周期的早期阶段起重要作用。 NS蛋白也是主要的候选物为招募结构蛋白到病毒工厂也为随后装配进入病毒粒子。转染细胞表达 NS和各种其它病毒蛋白的检测表明，当与 NS结合表达时，只有 A和 NS再分配到球形内含物内 (图 . 3)。这些结果与观察到 A和 NS出现在病毒工厂的侵染细胞内表明， NS调节这两种蛋白选择性招募进入禽呼肠孤病毒侵染细胞的工厂里。而且在三重转染细胞实验显示， NS招募 A进入内含物的能力是不
12、能被 NS的表达所抑制。这个发现结合观察到 A和 NS两者出现在单个 NS内含物内，并且这两种 蛋白的结合对于区分 NS位点表明 A和 NS通过与相同的 NS分子非竞争性的相互作用后被招募到病毒工厂。与 A和 NS相比，细胞内核心蛋白 A和外衣壳蛋白 C的分布不受 NS共表达的影响 (图 . 3)表明，它们两者通过 NS依赖的机制穿梭进入工厂，并且它们并不需要工厂形成的开始步骤。集合这些数据表明，病毒蛋白的招募进入禽呼肠孤病毒工厂是一个选择性和暂时控制的过程，它确定病毒蛋白通过与 NS联系在一开始就穿梭到工厂。而其它的招募者通过与到目前为止还未知的因素的相互作用。据报道与禽呼肠孤病毒位置相比，
13、每一个哺乳动 物呼肠孤病毒核心蛋白1, 2, 和 2独立的被招募到转染细胞 NS的内含物，表明三种核心蛋白通过与 NS特定的结合穿梭进入哺乳动物呼肠孤病毒的工厂 30。因此，禽流感和哺乳动物呼肠孤病毒的出现使用不同的机制为招募它们的同源核心蛋白 A和 2到它们各自的病毒工厂。有可能的是所有禽呼肠孤病毒基因的克隆和表达将能够识别所有病毒，它的工厂招募是 NS依赖的和病毒因素涉及 NS依赖的其它结构病毒蛋白的招募。这个信息可以用来了解蛋白团进入工厂和病毒颗粒的时间进程。 2. 核心装配 禽呼肠孤病毒核心装配需要用协调的方式把 蛋白质的部件结合在一起，十个病毒mRNA的每一个拷贝是选择性和 用壳体包
14、裹的 ，并且这些 mRNA随后用作互补链合成的模板，为了再生出全部十个双链 RNA基因组片段。 虽然免疫荧光电镜已经成功的用于监测转染细胞中呼肠孤病毒蛋白与 NS内含物的联系。个体蛋白招募进入侵染细胞的病毒工厂和病毒粒子内不能够直接被免疫化学技术检测，因为抗体不能区分空载和包含体相关蛋白。为了克服这个问题，设计了一个实验方法，把代谢脉冲追逐放射性标记与细胞分馏和抗体免疫沉淀结合起来。区分这种途径的能力是基于 Triton X-100抑制裂解缓冲液 的能力，以前用于区分可溶性和细胞骨架联系的呼肠孤病毒蛋白 31，溶解的自由蛋白可广泛分布在整个胞浆，而内含物相关蛋白能保持抵抗缓冲液的提取 (图 .
15、 4A)，这个结合途径的结果显示， NS是最近合成的病毒多肽，只与不溶性部分有联系 (图 . 4B)，表明，当 NS一合成时就形成球形内含物，并且所有其它病毒蛋白在变成与 NS内含物结合之前在细胞内合成。 核心装配被来自氨基酸 35S脉冲追逐细胞的可溶与不溶提取物与单克隆抗体对照核心蛋白 A的免疫沉淀确定 (图 . 4D)。结果显示，核心装配是一个复杂的和暂时的控制过程，只 在病毒工厂内发生。这些数据进一步表明，在这些蛋白质部件的合成之后，核心在开始的 30分钟内完全形成。只有当它们完全装配时，外衣壳蛋白团在它们外面产生成熟的呼肠孤病毒。虽然还没有被直接的测试，但核心装配只在病毒工厂内的事实表
16、明，这些结构也是 mRNA依赖负链合成的位点。这个假说被最近观察到巨大数量的转录病毒mRNA位于哺乳动物呼肠孤病毒侵染细胞的工厂里所支持。也被最近由 Silvestri32的研究数据所支持。这个研究的结果表明，在轮状病毒侵染细胞中，有两种不同类型的正链RNA病毒，那些从来没有离开病毒形成圈， 它是为负链 RNA合成作为主要的模板资源。并且这些超过病毒形成圈的 RNA结合能力释放进入细胞质为在核糖体上病毒蛋白合成的过程。他们的结果进一步表明轮状病毒 mRNA释放进入细胞质不能够被运输回来进入病毒形成圈，因此，不能够被用作负链合成的模板。 图 . 3 在转导细胞内 NS/GFP-NS和其它禽呼肠孤
17、病毒蛋白分布的免疫荧光电镜分析。重组的质粒转染到鸡胚培养的单层成纤维细胞中在左侧表示出来了。在转染的 18个小时以后，细胞被 DAPI染色（ C列）或经抗体标记的免疫组织化学（ B列）反应 NS（ 2和 7排），禽呼肠孤 病毒核心（ 3和 8排），C（ 4和 9排）和 A（ 5和 10排）。正如 NS， GFP-NS形成球形团并调解 NS招募进入工厂（ A列）。详见文章。 With permission from Tours-Otero et al. 2004a) 禽呼肠孤病毒形态出现的第一步是 A核心衣壳的形成，因为这个主要的核心蛋白是第一个结构蛋白进入病毒工厂 (图 . 4A)，它的招募是
18、被 NS调解的 (图 . 3, 框 8)。通过比较，A的出现结合在核心形态的后一个阶段，通过 NS依赖的机制。一个最近的研究使用禽呼肠孤 138衍生 的温度敏感型在主要的核心蛋白 A中携带病变的突变体，这个蛋白质在禽呼肠孤病毒形态发生上具有一些轻微的作用。细胞侵染的突变体 tsA12在 A蛋白的 158位残基包含有脯氨酸被亮氨酸替代。在非允许条件温度下比允许条件温度下积累了更高的核心样颗粒比例。表明 A在核心被外衣壳蛋白覆盖起重要作用。在另一方面，当种系138衍生的突变体 tsA12编码的 S2基因也包括由 tsA12而来的 B和 NS编码的基因。这个结果表明在三种蛋白质之间有种系特定的相互作
19、用，增加了 NS和 B可调节 A招募进入禽流感病毒工厂的可能性。最后，在 对携带有第 55位残基的脯氨酸被丝氨酸替代和 290位苯丙氨酸被异亮氨酸所替代的温度敏感型突变体 tsA146的研究表明，当细胞在限定温度下侵染突变体与在允许温度下转染相比，增加了完整病毒颗粒的比例和减少了空载病毒粒子的比例的重要作用 。 这个结果与 A对稳定 A衣壳的作用相一致。因为减少突变体 A对衣壳的亲和力将会导致更多的 RNA在 A衣壳对 RNA的渗透变得僵化和顽固之后进入新生后代颗粒。这个假说被呼肠孤病毒科家族的其它成员所获得的结果所支持。因此，通过对哺乳动物呼肠孤病毒核心 2的 X-射线结晶学分析显示，禽呼肠
20、孤 病毒 A所对应的成份位于 1衣壳的顶部并固定 1。进一步说，虽然哺乳动物呼肠孤病毒核心蛋白 1的表达并不是以产出可以经受纯化的核心样粒子。 1的共表达和核心结构蛋白 2产生的纯化抵抗颗粒表明 2能稳定 1的核心衣壳 33,34。在另一方面，通过 X-射线结晶学对蓝舌病毒核心结构分析显示一个脆弱的核心内衣壳刚开始是由 VP3蛋白形成的，并且这个结构比在 VP3衣壳顶部的 VP7结合的更坚硬 35。结合这些结果表明，同源蛋白 2, A, 和 VP7作为夹子稳定由各自病毒的主要核心蛋白所形成的衣壳。与呼肠孤病毒或环 状病毒的情况相比，大量的轮状病毒核心蛋白 VP2大多数单独表达的产物稳定核心样颗
21、粒 36。表明VP2的稳定活动并不需要轮状病毒粒子的最里层蛋白衣壳的形成。 虽然特定的抗体和 基因克隆对评价 NS的依赖性和所有其它禽呼肠孤病毒核心蛋白进入病毒工厂和病毒核心的结合的时间顺序是明显需要的。在可溶性和不溶性部分蛋白质的分布检验表明蛋白质 B比 A更早与病毒工厂结合 (图 . 4A)。在另一方面，通过对哺乳动物呼肠孤病毒情况的分析，如果 NS调解核心蛋白 A招募进入禽呼肠孤病毒工厂，并且如果 C是完整的核心形态蛋白，那么主 要的禽呼肠孤病毒核心中间体可能通过B和 A添加到 A核心衣壳而形成，并且核心装配可能随后通过蛋白 A 和 C的结合而完成。这个模型与哺乳动物所对应的禽呼肠孤病毒
22、蛋白所占据的核心结构位置是一致的。因此，哺乳动物对应的 B和 A位于核心衣壳的下面，而 A和 C对应的位于衣壳的顶部 37。 病毒工厂在呼肠孤病毒形态上的准确作用还不清楚。在另一方面，到目前为止对呼肠孤病毒科家族的全部成员的调查显示在细胞内的病毒工厂里装配，表明这些专门的结构对侵染细胞内病毒的复制和包装是必需的。另一方面，在呼肠孤病毒科家族中，病 毒工厂的出现对病毒蛋白的装配进入粒子是可有可无的。因为核心样颗粒可以通过来自重组的杆状病毒和牛痘病毒对呼肠孤病毒、轮状病毒和蓝舌病毒核心蛋白的表达而形成38。这说明核心蛋白可以装配成粒子的外工厂。然而，关于病毒工厂的绝对需要为核心形态的调解存在着明显
23、的矛盾。考虑到：（ a）在杆状或牛痘病毒侵染细胞中所产生的病毒样颗粒是空载的缺乏病毒 RNA的粒子。（ b）粒子形成的效率可以从重组蛋白的减少和蛋白装配数量的增加看出。后者的观察似乎表明病毒工厂可能对病毒蛋白的选择性招募是非常重要的在时间顺序和适当的范围一样需要最 大的核心装配效率。这些假说的一致性是病毒蛋白选择性的招募进入工厂已经显示了在禽呼肠孤病毒侵染细胞内的发生。在另一方面，最近的研究显示，脱壳后变成 内涵体 制约 NS的夹杂物，许多父母的哺乳动物呼肠孤病毒核心粒子释放进入细胞质，因为哺乳动物呼肠孤病毒蛋白 NS的核心结合活动。 因此，它的出现伴随着 NS的合成和工厂的形成。病毒 mRN
24、A在病毒工厂内合成，这反过来表明工厂可能也要求保持和集中最近合成的对包装和复制所必需的病毒mRNA。而且，据推测在核心形态的早期阶段期间这个活动是必需的。因为蛋白 的夹紧活动导致衣壳变 得很严格之前，病毒 mRNA被认为已经进入了核心衣壳。在这个情形中，非结构蛋白 NS的出现就像为保持病毒 mRNA在禽呼肠孤病毒工厂所候选的。因为这个蛋白具有 RNA结合活性并且通过特定的与 NS结合使它很早就被吸收进入工厂。来自我们实验室最近的结果显示（未发表的数据），禽呼肠孤病毒 NS的 RNA结合活性对于 NS的结合可有可无，表明 RNA没有作用于 NSNS的结合。形成对照的是，据报道RNA是有作用的，虽
25、然不是严格需要，哺乳动物呼肠孤病毒非结构蛋白 NS和 NS的结合 39。这个差异可能与不同的 RNA结合 结构需要两种 NS蛋白有关。因而，虽然哺乳动物呼肠孤病毒 NS的 N-末端 118位残基足够的结合 RNA，基本的残基沿着整个禽呼肠孤病毒 NS序列的广泛分布对 RNA的结合是必需的 40。 图 . 4A-F 禽呼肠孤病毒多肽招募进入病毒工厂和病毒粒子的电泳分析。鸡胚单层培养的成纤维细胞模拟感染（ M）或用禽呼肠孤病毒感染（ AR） 14个小时，接着将细胞放在 35S标记的氨基酸内孵化15分钟，再经包含有过量的非放射性蛋氨酸和半胱氨酸下继续孵化一段时间在顶部表示出来。细胞随后用含有 Tri
26、ton X-100的缓冲液裂 解，其产物的可溶性和不溶性部分通过 SDS-PAGE和在这之前用放射自显影（ A）或者与抗体免疫沉淀之后并分析，在左上角的 BF表示出来。详见文章。 (With permission from Tours-Otero et al. 2004a) 在体外虽然 NS已经显示缺少特异性的与病毒序列结合，而在侵染细胞内，一个病毒辅助物可以提供 NS与 RNA结合的特异性。在缺乏实验证据的情况下，一个辅助候选物是 NS，在侵染细胞内它与 NS的结合并调解它招募进入病毒工厂。另一个可能性是细胞的 mRNA被排除并且不允许渗透进 入工厂。排除 NS相关的对病毒序列具有偏好的需要
27、。在这个情景中， NS只能保持病毒 mRNA在工厂里，并且只有当病毒 mRNA在工厂里的数量超过 NS的 RNA结合能力时，过量的转录产物将会被释放到细胞质里为在核糖体上进行病毒蛋白的合成。因为病毒工厂不包含核糖体。而且，如果对 Silvestri32所报告的轮状病毒的情况进行分析，这里没有贩运途径允许细胞质病毒 mRNA运输回到工厂，呼肠孤病毒 mRNA从工厂释放进入细胞质只能被翻译使用，不能用于负链的合成。 3. 核心层 核心层外壳的多肽对于完成细胞内成熟的传染性 呼肠孤病毒的产生是必需的。这一过程由通过来自 35S氨基酸脉冲追逐细胞提取物与抗体对照的外壳蛋白 B和 C的可溶和不溶的免疫沉
28、淀的研究 (图 . 4E, F)。这些显示核心层外壳蛋白只存在于病毒工厂内，并且核心装配和核心层并非同时发生的连续事件。他们进一步表明在细胞质里 B 自发并快速的与 和 BC结合形成三元杂低聚复合物，包含有三种相同数量剂量比的病毒蛋白，这三种病毒合并进入核心粒子形成该复合体的一部分。在另一方面，即使 B和 C在刚开始合成时就可以在病毒团内被觉察到 (图 . 4E, F)，但是它们也不能与核心 蛋白结合直到 30分钟以后。实际上这个病毒结构蛋白的全光谱共免疫沉淀在开始合成的 60分钟之内也不能够被发现。核心装配被证实是在开始的 30分钟之后病毒蛋白部件的合成。暗示核心被外壳蛋白覆盖是在下一个 3
29、0分钟时间里完成呼肠孤病毒的形态。对哺乳动物呼肠孤病毒所进行的研究显示高传染性哺乳动物呼肠孤病毒由纯化核心颗粒与重组的外层衣壳蛋白的形成重新装配 41。相似之处是轮状病毒核心和单层衣壳粒子的传染性可以通过添加从纯化的轮状病毒的中间体和外衣壳中分离的可溶性蛋白所营救 42,43。这些结果表明核心层可以从核心装配中 游离出来，并且外衣壳多肽的合并进入衣壳并不需要病毒工厂的出现。 4. 禽呼肠孤病毒基因表达和形态的一个模式和结论 虽然近年来在影响禽呼肠孤病毒复制和形态上的分子机制增加了进一步的了解，但是一些主要的问题还是没有被解决。我们最近获悉禽呼肠孤病毒后代粒子的装配只在球形细胞质的病毒工厂内进行，这些结构是由非结构蛋白 NS刚开始形成的。我们也发现NS调解工厂对非结构蛋白 NS和主要的核衣壳蛋白 A的招募，表明这三种蛋白在核心形态的早期阶段起重要作用。相反，核心蛋白 A并不是通过 NS依赖的机制穿梭进入工厂的事实表明 A并不涉及核心装配的第一阶段。进一步了解了其它禽呼肠孤病毒蛋白何时和怎样招募进入工厂并且由于缺少可利用的病毒克隆基因和特定的抗体而被阻止进入病毒粒子，虽然这些工具预期很快的就可以被利用。其它温度敏感型禽流感呼肠孤病
