1、毕业论文 文献综述 生物 技术 缢蛏分子遗传学研究进展 摘要 ：目前有多种技术被用于缢蛏的分子遗传研究， RAPD、 ISSR、 AFLP、等技术都对缢蛏的生物分子方面的研究具有显著的作用。三种技术根据不同的原理对缢蛏进行分子遗传研究，具有各自不同的特点并适用于研究。缢蛏的分子遗传研究已经取得了可喜的成绩，同样的也具有着广阔的研究前景。 关键词： 缢蛏 RAPD ISSR AFLP 群体遗传 缢蛏 (Sinonovacula constricta Lamark)隶属软体动物门、瓣鳃纲、异齿亚纲、帘蛤目、竹蛏科， 又名蛏子 ,广泛分布于中国、日本和朝鲜等国的沿海地区。但由于近年海洋环境急剧恶化
2、, 同时 , 随着缢蛏养殖面积的逐年扩大 , 缢蛏野生种质逐年减少。随着“蓝色革命”时代的迅速发展，海水贝类养殖等相关研究日益兴起，缢蛏为我国四大养殖贝类之一，对它的研究和开发利用受到越来越多的科研工作者的重视。本文就就用于缢蛏分子研究进展加以综述。 一、分子遗传学常用的技术 1.1RAPD 技术 1.1.1RAPD 技术的原理 RAPD（ Random Amplified poiymorphic DNA，随机扩增多态性 DNA）技术是由美国 杜 邦公司的 Wwlliams 和加里福尼亚生物研究所 Welsh 领导的两个研究小组于 1990年同时提 出的一种快速 、简便 、多态性检出率高、可自
3、动化分析的一项新的 DNA 分子标记技术 ,其方法是建立在 PCR技术基础上的 ,它以一系列人工合成的不同的随机排列顺序的寡聚核昔酸单链（通常为十聚体）为引物（ Primer）对所研究的基因组总 DNA（模板 DNA）进行 PCR 酶促体外扩增 ,扩增产物通过聚丙烯酞胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳分离 ,经 EB 染色（或银染或放射自显影）来检验扩增产物 DNA 片段的多态性 。其多态性反映了基因 组相应区域的 DNA 多态性 。 RAPD 分析所用的一系列引物的碱基序列不同 ,但对任一特定引物 ,它与所检测DNA(模板 DNA) 序列有特定的结合位点 。当引物在模板的两条链上有互补位置 ,引物3 端
4、相距在一定长度范围内（一般为 2002000bp） ,在 DNA 多聚酶催化下 ,就可扩增出 DNA 片段来。因此 ,当检测的模板 DNA 在这些区域发生 DNA 片段的插人、缺失或引物结合位点上的碱基突变时 ,PCR 产物就会增加 、缺少或发生分子量的改变 。虽然对每一引物而言 ,其检测基因 DNA多态性是有限的 ,但可用的引物数很 多 ,可检测区域几乎覆盖整个基因组 。所以 RAPD 可以对整个基因组的 DNA 进行多态性检测 。这就是 RAPD 检测多态性 DNA 的原理。 1.1.2RAPD 的特点 RAPD 技术不仅继承了 PCR 效率高、特异性强和检测容易的特点 ,而且与其他DNA
5、 分子标记相比起来 ,有其独到的优势，利用 RAPD 建立的遗传图谱 ,具有以下一些特点 (1)RAPD 技术可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下 ,对其进行 DNA 多态性分析 ,构建这些物种的基因指纹图谱 ,并通过统计分析为遗传分析和分类研究提供DNA 分子水平的依据 ,这是其他方 法 (如 RFLP)所不 能比拟的 (2)此法技术简单 ,易于操作 . 它可以直接对生物基因组 DNA 多态性进 行分析 ,引物的设计是随机的 ,因而无需做克 DNA 探针的分离 ,杂交膜的准备及核苷酸序列分析等前期工作 ;(3)试验只需少量的DNA，高效灵敏 。极少量材料 （一片叶子 、一段根尖 ,甚至
6、几个细胞）所含有的 DNA即可满足需要 ,并且不受季节 、组织器官发育时期的限制 (4)无放射性污染， RADP 操作安全 ,不需用同位素示踪 ,并且所用试剂毒性小 ,对人体一般不构成危害 (5)较之RFLP 标记的遗传图谱更有效 ,具有更大 的标记密度。但它也有缺点 ,RAPD 标记是显性标记 ,不能区别纯合体和杂合体 ,从而使它提供的遗传信息不够完整在某些作物中 ,扩增的稳定性差 。这些缺点的克服只有通过严格保证反应条件来解决。 1.2ISSR 技术 1.2.1 ISSR-PCR 的原理 基因组中分布有以 2 6 bp 为单位多次串联重复的微卫星 DNA 序列 , 如二核苷酸重复序列 AT
7、、 GA、 CT、 AG、 AC、 TC 等 , 三核苷酸重复序列 AGC、 ACC、 CTC、TAT 等 , 四核苷酸重复序列 CCCT、 CTAG、 GATA 等 , 五核苷酸重复序 列 CTTCA、GGAGA 等。这种分布于常染色质、 高度重复的简单序列 ,称为微卫星 DNA ( M icrosatellites DNA ) , 也称简单重复序列 ( Simple sequence repeats , SSR)或短串连重复 ( Short tandem repeats , STR )。早在 1974 年 , Skinner 等研究寄居蟹基因组的卫星 DNA时就发现基因组内存在 SSR;
8、Hamada 等报道从酵母到脊椎动物 , 所有真核生物的基因组中均能发现 poly ( dT-dG ) n 核心序列的 多拷贝短序列 ; 此后 Tautz 等、 Stalling 等发现在人、 老鼠、 鸡及多种植物等真核生物的基因组中广泛存在 SSR, 其不仅分布于内含子、 编码序列及外显子中 ,也可散布在 2 个或多个 SSR 组合之间 , 是真核生物基因组重复序列的主要组成部分 , 且种属越接近 , 其 SSR 侧翼序列同源性越高 ; 在同属的不同种内 ,其 SSR 序列存在相同部分。 ISSR- PCR 技术根据真核生物中广泛存在 SSR 的特点 ,利用基因组中常出现的的短核苷酸序列 (
9、 2 6 bp)为基本单位设计引物 ,引物通常为 20 个左右的碱基 序列 ,由 2 4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成 , 即在 SSR 序列的 5 或 3 末端增加 2 4个随机核苷酸 ,既保证了引物与基因组 DNA中 SSR的 5 或 3 末端结合而保障特定序列位点的退火 ,又降低其他可能靶标退火的几率 ;以此作为引物 ,可对反向排列重复序列间长度适中的基因组片段进行 PCR 扩增 ,以此来检测 2 个 SSR 之间的一段短 DNA 片段差异。 扩增产物经过电泳及染色观察结果 , 每个泳道可产生条带的多少取决于不同的物种和引物 , SSR在真核生物中的分布非常普遍 ,且进
10、化变异速度非常快 ,因而锚定引物的 I SSR-PCR 可同时检测基因组多个位点的差异。根据电泳条带的相对位置信息 ,可分析样品之间 ISSR 标记的多态性。 1.2.2 ISSR- PCR 的特点 ISSR-PCR 在进行分子遗传研究的过程中即表现出了比一般方法更优秀的地方，但是也不可避免的存在一些缺点。 ISSR 标记相对于其他标记方法更简便、 快捷 ,无需预先克隆和测序获得微卫星的侧翼序列 , 不必知道靶标序列的 SSR 背景信息 , 适用于任何含有 SSR 序列的物种 ,即所有的真核生物及少部分原核生物 ; I SSR- PCR中引物增加了锚定碱基 ,扩增中基因组上只有与锚定核苷酸匹配
11、的那些位点才能被靶定 ,增强了结合的专一性 ;对模板要求量少 , 一般不需纯化 ;可显示更高的遗传多态性 ; 成本较低 , 试验重复性和稳定性好 ,适合大样本量检测。 ISSR-PCR 反应条件要求高 , 需要摸索 PCR 反应的最适反应条件 , 需对 Mg2+、dNTPs 、 引物浓度、 Taq DNA 酶用量、 退火温度、 反应程序等进行优化 ,以获得理想结果 ;需要从通用引物中筛选 ,找到扩增条带清晰、 稳定、 重复性好的引物 ; I SSR 标记为显性标记 , 但与 RAPD 相 似 ,不能确定检测位点是纯合还是杂合 ,因此不宜用于杂合度分析。 1.2.3 ISSR-PCR 技术在遗传
12、多样性研究中应用前景 DNA 分子标记技术在物种遗传结构、 遗传多样性研究等方面具有巨大潜力 ,可揭示群体遗传多样性 ,是评价生物种群资源生存和进化的重要途径。 I SSR- PCR 技术不需知道序列信息即可检测微卫星的多态位点 ,已被广泛应用于物种和种群遗传多样性分析、 种质分析、 育种标记等方面。目前 , I SSR-PCR 技术已在各种蔬菜、 水果、 林木等作物上得到广泛应用 ,但在动物上的应用相对较少。 ISSR 标记的 主要缺点是非共显性 ,但随着分子生物技术的发展 , I SSR-PCR 技术将不断完善 , 结合其他标记方法及表型分析等多种途径 , 将获得理想结果。同时 , I S
13、SR-PCR 技术揭示的是整个染色体上分布均匀的 SSR 多态性 ,填补了连锁图的空隙 ,对 DNA 指纹图谱、 遗传图谱的构建具有重要意义。 1.3AFLP 技术 1.3.1 AFLP 技术的原理 基因组 DNA 经过限制性内切酶消化后 , 产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头 ( artificial adapter) ,该接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端 ,互 补连接后成为DNA 模板。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物由 3 部分组成 : 核心碱基序列 ( core sequence , CORE) , 该碱基序列与人工接头 互补 ; 特异性 酶切
14、序列 ( enzyme specific sequence , ENZ) ; 引物 3端选择性碱基( selective ex ten s ion , ENT ) 。选择性碱基延伸到酶切片段区 , 这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。 1.3.2 AFLP 特点 AFL P 分子标记的特点主要表现在：信息量大、多态性丰富、灵敏度高、可重复性强 ,不需要预先知道研究对象的遗传背景 ,分析所需 DNA 量少 ,受反应条件影响不大。理论上讲 ,由于 AFLP 分析采用的限制性内切酶及选择性碱基是大量的 ,因而能够产生的标记是无限的。一般每个 AFLP 反应可检测的位点多达
15、50100 个 , 提供的信息量大 ;结果稳定可靠并呈典型的孟德尔遗传 ,而且扩增片段大多与基因组单一位置相对 ,可以用做遗传图谱和物理图谱的位标。 1.3.3AFLP 在海洋生物中的应用 AFLP 具有灵敏度高、 信息量大、 呈 孟德尔遗传等特点 ,且不需预先知道研究生物的遗传背景 ,因此受到了海洋生物广大研究人员的青睐 ,在生物学的各个领域得到了广泛应用： (1)群体遗传结构分析， AFL P 信息量大、 灵敏度高、 能够检测亲缘关系非常近的材料之间的差异 ,因此利用 AFL P 分析海洋生物的遗传多样性水平 ,对海洋种质资源保护、 遗传育种具有理论指导意义； (2)基因的表达与调控研究，
16、主要是通过cDNA-AFLP 分析 ,研究基因不同时空的表达 ,它降低了经典 mRNA 差异显示技术的假阳性率 ,同时对低水平表达基因更敏感 ,并使操作更安全 ； (3)遗传育种操作效应监测、种质鉴定， AFLP 分子标记是中性选择的 ,因此可用于研究亲本对后代群体种质的贡献及基因追踪等方面； (4) 遗传连锁图谱的构建，遗传连锁图谱的构建是遗传学研究的一个重要领域 ,它在分子标记辅助育种、基因定位与克隆、比较基因组作图等方面有重要的应用价值。因为 AFLP 技术呈孟德尔遗传 ,一次反应可以检测大量的多态位点 ,且不需预先知道研究对象的遗传背景 ,因此在遗传背景了解相对较少的海洋生物中 ,被广
17、泛应用于连锁图谱的构建。 二、 缢蛏分子遗传学的研究进展 2 1 不同地理群体遗传多样性及 遗传变异的研究 王冬群 , 李太武 , 苏秀榕等采集了浙江象山港、浙江象山外海、福建宁德、浙江乐清、辽宁庄河、广东深圳 6 个群体的缢蛏 , 体各 100 个 , 采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法 , 对缢蛏的 GDH 同工酶进行了标记。结果象山外海群体检出一条带 GDH- 2; 宁德和象山港群体有两条迁移率相同的酶带 GDH- 2、 GDH - 3; 乐清群体中检出 3 条带 , 均为单态 ; 深圳群体中只检出 GDH- 3, 为多态 , 有两个基因编码 ; 在庄河群体中检出 3 个位点 , 其中
18、GDH - 3 为多态 , 有两 个基因编码。 深圳和庄河群体均有两个基因编码的杂合子出现 ,它们的迁移率分别为 100, 109。对这两个群体的多态位点进行了统计 , 深圳群体的杂合度观察值明显高于庄河群体 , 杂合度预期值相近 , 在庄河群体中杂合子偏离指数为负数 , 也就是说存在着杂合子缺失现象 ; 而在深圳群体中 d 值为正值 , 即杂合子过剩。造成这种原因可能是深圳群体的缢蛏是一龄蛏 , 个体较小 , 而其它种群都是 2 3 龄蛏 , 自然选择在缢蛏的不同发育阶段的影响造成了这种杂合子偏离情况的不同。同工酶的表达及活性与个体发育阶段是相关的 , 深圳群体 酶谱显著不同于其它群体可能与
19、其发育阶段有关。 2.2 野生和养殖群体间的遗传差异分析 姜志勇 , 牛东红 , 陈慧 , 沈和定 , 李家乐采用 PCR 技术对福建缢蛏的霞浦野生群体 (WP)和漳湾养殖群体 ( CZ)进行了 I TS-1 和 I TS-2 的多态性分析。利用贝类通用引物扩增了 ITS-1 和 ITS-2 序列 , PCR 产物经纯化、 测序、 同源序列比对 ,获得长度分别为 495 bp 的 I TS-1 和 485 bp 的 ITS-2 核苷酸序列 ,其中分别包括 25 bp 和 22 bp 的插入缺失。 I TS-1 和 ITS-2 片段的 T、 C、 A、 G 四种碱基的平均含量分别为 13 . 6
20、%、30 . 2%、 28 . 3 %、 29 . 7% ( ITS-1), 16 . 2%、 33 . 7%、 19 . 5%、 30 . 6% ( I TS- 2), A+ T含量显著低于 G + C 含量。序列分析显示 , 野生群体和养殖群体的单倍型多样性指数、 多态位点数、 平均核苷酸差异数分别为 1 . 0、 40 、 10 . 54( I TS 1), 0 . 96、 27 、 11 . 91( I TS-2)和 1 . 0、 28、 8 . 23 ( ITS-1) , 0 . 96、 28、 10 . 16( ITS-2) ,揭示出福建两个缢蛏群体的遗传多样性均较为丰富 , 其变
21、异主要源于碱基的插入和缺失 , 野生群体的多样性较高于养殖群体 , 但是遗传组成存在着较高的一致性 , 群体间没有遗传分化。 三、 缢蛏分子遗传学研究展望 3.1 高效分子标记（ AFLP、 SSR、 SNP）开发 SRAP 与 TRAP 是最近发展的新型分子标记系统 ,具有简单、 高效、 高共显性、 重复性、 易测序等优点 ,尤其是可检测基因的可译框 (ORFs)区域。引物设计是 SRAP 与 TRAP 分析的关键 ,目前已开发出多个 SRAP 正、 反向引物 ;与 SRAP 标记技术无须任何序列信息不同 ,TRAP 技术需要基于已知 cDNA 或 EST 序列信息设计固定引物才可进行 PC
22、R 扩增 ;二者 PCR 条件采用复性变温法 ,前 5 个循环复性温度为 35 ,后 30 35 个循环为 50 ;扩增产物可在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上电泳 ,同位素或银染、 EB 检测。目前这两种标记系统已开始在多种作物的种质资源鉴定评价、 遗传图谱构建 (包括转录图谱 ) 、 重要性状标记乃至基因分离克隆等方面成功应用。 3.2 遗传研究前景 目前，只见到缢蛏近缘种的细胞遗传学研究报道，但缺乏缢蛏自身细胞和分子水平的研究。另外由于近年海上活动的日益增加，海上活动日趋增多、海洋环境急剧恶化、海洋资源严重受损，缢蛏遭遇着同样的命运，野生种质逐年减少，加之我国缢蛏养殖业的迅速发展，异地引种日益频
23、繁，从而导致基因污染等。为了保护缢蛏种质资源的遗传多样性，合理开发资源，促进缢蛏资源的可持续性利用和管理，应该高度重视种质资源等基础研究。 小结 缢蛏作为我国四大经济贝类之一，其养殖业已经兴起，市场前景看好。为了研究其遗传性状以及能够更进一步 的研究出优良的缢蛏种苗，科学家运用各种不同的技术对其进行分子遗传上的研究，目前被应用于研究的包括 RAPD、 ISSR、 AFLP 等技术，并取得了卓著的成效，缢蛏的分子遗传研究随着进一步的深入具有着广阔的研究前景。 参考文献 1 王斌 ,翁曼丽 .AF LP 的原理及其应用 J . 杂交水稻 ,19 96(5) :27 - 30 . 2 翁跃进 .AF
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