1、 毕业论文 开题报告 生物 技术 海藻酪氨酸酶的分离纯化及性质研究 1. 课题研究意义及国内外研究现状 酪氨酸酶又称多酚氧化酶 ,广泛存在于微生物、动植物和人体 ,它具有单酚酶活性和二酚酶活性 。 在机体内它能将 L2酪氨酸羟化 ， 产生邻位二羟基苯丙氨酸 ( L2多巴 ) ， 再将多巴氧化成多巴醌 ,进而生成一系列引起褐化的色素类物质 。 是皮肤黑素生物合成的关键酶 ,不仅决定黑素合成的速率 , 还是黑素细胞分化成熟的特征性标志。酪氨酸酶是一种含铜的金属酶 , 每 1个亚基含 2个金属铜离子 ,2个铜离子分别与蛋白质分子中组氨酸结合 ,另有 1 个内源 桥基将 2个铜离子联系在一起 ,构成酪
2、氨酸酶催化氧化反应活性中心。酪氨酸等物质与酶形成过渡态络合物时 ,主要是羟基与酶的活性中心上的原子键合而发生作用。 它 的活性与黑色素的生成有密切的关系。 酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关 ,不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位不同 。 多数昆虫在正常生理状态下 ,酪氨酸酶以酶原的形式存在 ,不同类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位 ,以完成特定的生理功能 。 哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中 ， 使体表着色 ,从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过 热等作用 ， 哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中 ， 黑素细胞是存在于皮肤 ,发囊和眼睛中并产
3、生色素的高度特异性的细胞 ， 酪氨酸酶功能减退或缺失时 ,即会影响黑色素代谢 ， 从而发生疾病如白癫疯和白化病 ， 动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关 。 近年来 黑色素在防紫外线辐射、清除自由基、作为无定形半导体、化妆品、以及生物杀虫剂的光保护剂等方面都具有广阔的应用前景 。 酪氨酸酶的抑制剂可被作为化妆品中的增白剂如熊果甙和曲酸 ,因此可以以酪氨酸酶作为研究对象寻找更好的美白剂 。 同时 ,人们一直在研究酪氨酸酶活性的抑制剂和激 活剂 ,为色素沉着、黑色素瘤以及白癜风等色素疾病的预防和治疗寻找新的手段。目前 ,对酪氨酸酶的研究主要集中在酶的分离纯化、催化机制、活性调
4、控以及酪氨酸酶基因及其在生物体内的生理作用等方面 ,并且人们已经从微生物、植物及多种动物中提取并纯化了酪氨酸酶 。 宁波是沿海城市，海藻资源及其丰富，已有的研究表明： 海藻中含有的脂类、苷类、氨基酸、酸类、多肽、胡萝卜素、甾类等生物活性物质，其药用和美容功能正被逐步研究开发。尤其是 海藻多糖种类繁多、来源丰富，它不仅能提高机体免疫功能，而且具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、降血脂及抗凝血等 多种生物活性。 将地方的丰富资源 海藻充分利用起来，将其用于酪氨酸酶的提取纯化，同时将其内的活性物质与酪氨酸酶的生物学活性合并研究，探究其相互作用，为进一步研制出新型药物和化妆品等提供理论依据。 2. 课题研究的
5、主要内容、预期目标和研究方案 主要研究内容 ： 1 海藻酪氨酸酶的提取纯化工艺的研究 ;包括粉碎匀浆、沉淀离心、盐析、透析、离子交换、分子筛等纯化条件的研究。 2 海藻酪氨酸酶的生物学特性研究：包括分子量、最适 pH 值和最适温度、 Km 和 Vmax、热稳定性 、 pH稳定性、离子稳定性 等。 3 海藻中常见生物 活性物质对酪氨酸酶活性的作用：包括脂类物质、多肽氨基酸类、萜类、甾类、多糖类物质对酪氨酸酶的影响，重点研究海藻多糖的影响效果及利用。 项目预期目标 ： 1 相关研究论文 2-3 篇 。 2 争取专利 1 项 实施方案： 1 海藻酪氨酸酶的提取纯化工艺的研究 。 1.1 通过对单因素
6、实验，进行工艺流程的探索研究，最佳离心条件；最佳盐析试剂及浓度；最佳透析时间；最佳离子交换梯度洗脱浓度、洗脱速度、洗脱时间；最佳分子筛分离条件的设置等。 1.2 通过正交实验对分离纯化工艺流程进行优化 2 海藻酪氨酸酶的生物学性质研究： 2.1 利用 SDS-PAGE 电泳检测蛋白纯度和测定分子量。 2.2 采用 Bradford 法测定蛋白质含量。 2.3 以不同 pH(4. 0 10. 0) 的 Tris-HCl 缓冲液为介质 ,在 30 下测定酪氨酸酶活性，测定其最适 pH 值。 2.4 在最适 pH 条件、不同温度 (15 80 ) 下测定酪氨酸酶活性 ,作温度 - 酶活性变化曲线，求
7、出最适温度。 2.5 酶的动力学研究。以 L2DOPA 为底物 ,改变底物浓度 (1 8 mmol/ L) ,在最适温度和 pH 条件下测定酶在不同底物浓度时的酶活力 ,并按 Lineweaver-Burk 作图 ,求出 Km、 Vmax。 3 酪氨酸酶的稳定性研究： 3.1 酶的 pH 稳定性研究：将一定量的酶分别保存在不同 pH(4. 0 10. 0) 的 Tris2HCl 缓冲液中 ,30 放置 24 h ,然后在最适 pH 和温度条件下测定其活性 ,作出 pH - 酶活性变化曲线。 3.2 酶的温度稳定性研究 :将一定量的酶分别放置在不同温度 (20、 40、 60、 80 ) 下 ,
8、分别保温20、 40、 60 min ,并在最适 pH 和温度条件下测定其酶活性 ,作出温度 - 酶活性变化曲线。 3.3 酶的离子稳定性研究：向酶液中分别加入 10 mmol/ L ,1 mmol/ L 的 Al3 + 、 Ca2 + 、 Co + 、Cu2 + 、 Mn2 + 、 Mg2 + 、 Zn2 + 离子 ,于 50 保温一段时间 ,在最适 pH 和温度条件下测定上述金属离子对其酶活性的影响。 4 海藻中常见活性物质对酪氨酸酶活性的影响 ： 4.1 海藻氨基酸对酪氨酸酶的影响。 4.2 海藻脂类物质对酪氨酸酶的影响。 4.3 海藻中萜类和甾类化合物对酪氨酸酶的影响。 4,4 海藻多
9、糖对酪氨酸酶的影响。 3. 课题进度计划 2010 年 4 月 -7 月：筛选提取酪氨酸酶的最佳常见海藻种类 2010 年 8 月 -10 月：确定海藻提出、分离、纯化酪氨酸酶的最佳实验方法和条件 2010 年 11 月 -12 月：海藻酪氨酸酶提取工艺条件优化 2011 年 1 月 - 4 月：海藻酪氨酸酶的性质研究 2011 年 5 月 -2012 年 4 月：海藻中常见活性物质对酪氨酸酶活性的影响 4. 参考文献 1刘晓丹 ,黄璜 ,陈清西 . 苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶抑制作用机理的研究 J . 厦门大学学报 (自然科学版 ) ,2003 ;42 :102 - 6 2徐迪 ,马林 ,张凌 ,
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