1、毕业论文 文献综述 生物 工程 微生物原生质体融合技术 摘要： 用 根霉和米曲霉 两种菌株为 亲本 菌株，分别用纤维素酶和蜗牛酶、溶菌酶的混合酶液制得了两个亲本的原生质体。在研究了培养时间、培养方法、酶解时间、酶解液的配比等条件对原生质体产量影响的基础上，以 PEG 诱导进行原生质体的融合，并进行紫外线照射的诱变育种。通过比较在菌落外观、颜色及形态上与米曲霉和根霉菌株的不同，以及进行 高酶活 筛选，获得一株具有较高酶活力的新菌株。 关键词： 米曲霉；根霉；原生质体制备；融合；筛选 前言 近年来，随着分子生物学和分子遗传学的迅速发展 ，原生质体融合技术已成 功 的应用于微生物的遗传育种中。原生质
2、体融合技术的特点是不依赖微生物自身的结合能力，而是将杂交的两个亲 本菌 株通过酶解作用 除去 细胞壁的高渗环境中 ， 释放只有原生质膜包被着的球状原生质体 1，然后在 特 定的条件下促使其互相融合，进而使两个亲 本菌 株的遗传物质之间发生接触、交换 来 产生重组体，并通过使原生质体再生细胞壁 ， 获得重组子。原生质体融合的基因重组频率不仅比一般杂交高，而且可将重组的范围由种内扩大到种间甚至属间。 1 原生质体融合技术 原生质体融合技术 (protoplast fusion)又称 为细胞融合技术，是指用酶 的方 法除 去 细胞壁，制成由原生质膜 包裹 的原生质体，然后采用物理、化学或生物学方法诱
3、导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，发生染色体交换、重组 从 而达到杂交的目的，并筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定重组体的一种育种方法 2。微生物原生质体融合技术是通过改变微生物细胞的遗传性进行育种，其可以在种内、属内、属间甚至跨界进行，并且在各个领域中都取得了一定的效果 3。 原生质体融合技术的整个过程包括：原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体的再生和融合子的性能鉴定等。 2 原生质体融合技术的研 究进展 1912年， Lam nbent在观察多核细胞形成的过程时首次发现了细胞融合现象。 1960年，日本的 Okada4-5发现并证明了紫外灭活仙台病毒可诱发体内艾氏腹水癌细胞彼此融合，
4、开拓了细胞融合研究的先河。 1953 年， Weibull 等用溶菌酶制备得到了巨大芽孢杆菌的原生质体，提出了原生质体的概念。 Eddy和 Emmerson又以酶法相继制备出了酵母菌和丝状真菌细胞的原生质体，为微生物的细胞融合开辟了道路。 1974年，加拿大籍华人高国楠发现聚乙二醇 (PEG)在 Ca2+矿参与下能促进植物细胞原生质体融合， 这一发现极大地促进了细胞融合技术的发展，使该技术跃上了新的阶段。在融合方法上，除了传统的化学方法外， 1980年 Zimmermann6等报道电场诱导细胞融合， 1988年张闻迪州等又报道激光诱导动物细胞融合，都进一步提高了融合频率。 1978年，第三届工
5、业微生物遗传学讨论会上，原生质体融合作为一种新的基因重组手段被提出来，引起了全世界的关注。此后，该技术逐渐深入到微生物的遗传、生理、代谢、形态方面的研究和工业菌株选育工作中，极大地推动了微生物研究的进程。 3 米曲霉、根霉原生质体的制备 3.1 菌丝培养 分 别刮取 长有 两亲本菌株 PDA 斜面上生长旺盛的米曲霉孢子和根霉接种于盛有 50 mL 菌丝生长培养基的三角瓶中 , 并在 32 , 150 r/ min的恒温摇床中培养 15 h。 3.2 原生质体制备 通过离心将菌丝与培养基分离 , 用渗透压稳定剂离心洗涤 2 次 ( 3000 r / min, 5 min) , 洗涤后置于离心管中
6、。加入配制好的酶液 , 在 32 恒温水浴中振荡酶解。 2. 5 h后 用 四层高级擦镜纸过滤 , 滤液离心分离 ( 3000 r/ min, 13 min) , 并用渗透压稳定剂离心洗涤 3次 , 收集原生 质体 放 于 0. 8 mo l/ L NaCl溶液中。 3.3 原生质体融合 3.3.1 化学融合法 目前最常用的是 PEG 助融法，将两亲本的原生质体等量混合在高渗 溶 液中，加入PEG助融，振荡促使原生质体融合。一般酵母菌原生质体融合时，选用分子量为 40006000的 PEG，终浓度为 30 40，再加入 Ca2+、 Mg2+等阳离子。关于 PEG助融的作用机理 一般 认为 PE
7、G使原生质体的膜电位下降，然后通过 Ca2+ 交联而促进凝集 7。由于 PEG具有很强的渗透伤害和化学毒性， 故 选用螯合剂乙二胺四乙酸（ EDTA）或乙二醇双乙胺醚（ EGTA）作为新的促融剂，对原生质体的再生率和融合率均有显著提，其作用机理可能在于螯合剂通过与原生质体膜蛋白上的二价阳离子结合，从而使膜脂流动性减慢，稳定性增强，提高再生率；与相邻两原生质体膜蛋白上的二价阳离子结合，从而提高融合率。由于不同酵母菌的原生质体生理特性不同，对具体的实验对象需要摸索出相应的最佳实验条件。 3.3.2 电融合法 电融合技术是利用直流或交流电场的作用，迫使两亲本原生质体融合。包括下述过程：细胞在电场中极
8、化成偶极子，沿电力线排列成串珠状；两极间的高压电脉冲击穿紧密接触的细胞 质膜，在细胞膨压的作用下完成融合。其优点是：融合频率高，对细胞无化学毒害，可在显微镜下观察融合全过程；还具有空间定向、时间同步可调控的特点。由于对设备的依赖程度较大，电激时间、电压梯度、交变频率等条件不易摸索，自 80年代初发明以来，一直难以推广。在酵母菌原生质体融合中，汪和睦、张博润、程东升等曾利用电融合法成功地进行了啤酒酵母的融合。 3.3.3 激光诱导融合法 利用激光束对相邻两个细胞接触区的原生质膜进行穿孔，使两个细胞的基因进行交换重组。目前用这种方法诱导动、植物细胞的原生质体融合已有大量 的 报道，但用于 酵母菌原
9、生质体融合 的 报道较少。 3.4 高酶活力菌株的筛选 分别将未诱变和诱变后的再生培养基平板长出的菌落接种到液体发酵种子培养基中， 30 摄氏度培养 36h后，按 5 %接种量接入液体发酵培养基中， 30 摄氏度 130r/min摇床培养 3-4d，分别测定蛋白酶活力，淀粉酶活力，重复 3次，选取酶活力有提高的菌株。 3.5 培养 诱导完整植株，融合后的原生质体经培养后会再形成细胞壁，形成愈伤组织，培养成 新 植株。 4 融合子的筛选 原生质体融合后，真正的杂合二倍体是极少数的，大多数异核体会产生亲型分离子，如何有效地筛选出 具有优良性状的融合子是 非常 重要的。融合子筛选的方法有很多，下面
10、例举几种 最常用的： 4.1 营养缺陷型标记 营养缺陷型标记是传统有效的标记方法 ， 融合的双亲株带有不同 的 缺陷型标记，融合后采用基本培养基可以很容易检 验 出融合子。 DAIMH等 8以大肠杆菌 (Escherichia coli)菌株 W4183与菌株 Fu201为亲本进行融合，在不加 Arg、 Leu的 M9培养基上得到融合子，融合率达到 0.05 0.7。 4.2 利用荧光染色法选择融合子 用不同的荧光色素染色双亲原生质体，使其在特定波长的激光下 显示 不同的 颜色，在荧光显微镜下，用显微操作器挑出有两种荧光色的单个细胞，即为融合子。利用这种方法 要 考虑荧光色素对原生质体的影响，
11、 和 两种颜色的分辨度。 此 方法应用于酵母菌原生质体融合中的报道并不多见。 4.3 碳源利用标记 利用亲 本菌 株对各种碳源利用的差异，结合其他特性分离筛选融合子。对于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌来说，前者为 G-，不产芽孢，不能利用淀粉；后者则为 G+，产芽孢，能利用淀粉，可以利用这些特性进行融合细胞的筛选 9。 5 原生质体的再生 酶解去壁后得到的原生质体具有再生能力，能重 新生长 细胞壁，恢复细胞完整形态并 能生长、分裂，这是原生质体融合育种的必要条件。由于原生质体己经失去了坚韧的外层细胞壁，仅有一层细胞质膜，是失去了原有细胞形态的球状体。因此，尽管具有生物活性，但它毕竟不是一种正常的细胞，
12、在普通培养基平板上也不能正常地生长、繁殖。为此，必须想办法使其细胞壁再生出来，以恢复细胞原有形态和功能。 由于仅有细胞质膜的原生质体对渗透压很敏感，很容易破裂致使原生质外流而使细胞死亡，所以，再生培养基必须与原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中加入具有一定渗透压的基质即渗透压稳定剂，这与原生质体制备一样。对于不同的微 生物来说，其原生质体的高渗再生培养基的主要成分是不同的。 原生质体的再生是一个十分复杂的过程，至今了解不多。据一些学者研究认为，若原生质体的细胞壁剥离不彻底，则有助于细胞壁的再生。残留的细胞壁尤如结晶时的 “晶种 ”一样。大量实验亦证明，破壁太彻底往往会引起原生质体再生率
13、的大大降低。 6 影响原生质体形成的因素： （ 1）酶的种类和浓度 细菌，多以溶菌酶或与其它酶混合进行酶解；霉菌，使用粗制蜗牛酶和裂解酶 (复合酶 )、 Novozym 234及溶壁酶等；酵母菌，则常用蜗牛酶和酵母裂解酶。不同种属的微生物，甚至需用同一 种酶的不同微生物，在制备原生质体时所需酶的最适浓度均有很大差异，应根据具体情况而定。 （ 2）酶解温度和 pH值 原生质体制备液的 pH 值和酶解温度直接关系到酶的解离基团的状态和活性基团的作用，进而直接影响到酶促反应的速率和原生质体化程度。对于不同微生物，应以保证酶活最高为原则来确定其最适酶解温度和 pH值。 （ 3）酶解时间 充足的酶解时间
14、是原生质体化的必要条件，但时间不可过长，否则再生率会显著降低。 菌体的生理状态。菌体的不同生理状态会直接影响到细胞壁的结构和菌体的代谢水平、菌体的活力等。对于绝大多数微生物多用对 数生长期前期、中期或后期的菌体来制备原生质体。 此外，影响因素还包括菌体的预处理、菌体的浓度和分散程度、洗液和原生质体制备溶液等。 7 影响原生质体再生的因素有 10： （ 1）影响原生质体再生有自身活性的因素，包括原生质体制备和贮存对再生的影响。 （ 2）再生培养基的选择。选择适合的再生培养基应考虑到培养基中的营养因子、原生质体保护剂和扩张剂、渗透压稳定剂以及再生细胞壁的引物和前体物质等方面。 （ 3）再生时的培养
15、温度。 （ 4）操作方法与再生方法。固体培养法与液体培养法的选择和固体培养中涂布法和双层培养法的选 择，还应考虑琼脂硬度和培养基的脱水程度、再生菌落密度等。 8 原生质体融合的应用 在实践中的应用体现在 2个方面：（ 1）获得新种质、培育新品种。体细胞杂交技术不仅能使近缘不亲和种内或种间植物。而且可使远缘不亲和的属间甚至科间植物产生体细胞杂种。使植物能够利用远缘的有用基因。从而扩大植物可利用的基因库。如果杂种植物可育，并能稳定遗传就可能培育出农业上有用的新品种。（ 2）转移细胞质基因。通过体细胞杂交能够转移多基因控制的性状，并且是目前唯一能使双亲胞质和核基因在杂种细胞中共存的技术。原生质体融合
16、涉及了双亲的细胞 质，它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中也可使叶绿体基因组与线粒体基因组重新组合。这为许多实验所证实并直接应用于植物育种。同时，值得一提的是原生质体融合技术不存在产品的安全隐患，可被人们普遍接受，具有十分广阔的发展前景：但也存在着如后代遗传不稳定、杂种细胞中异源基因一方排斥另一方等问题这还需要进一步加以深入研究和改进。 9 展望 原生质体融合技术能把亲缘关系比较远，甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段，它不仅打破了有性杂交重组基因创造新种的界限，更 重要的是扩大了遗传物质的重组范围，已经成为遗传育种的重要手段，寻找具有更
17、高融合效率的方法有着重要意义。如灭活原生质体融合、离子束细胞融合、非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法相继提出并应用于微生物育种中，这是原生质体融合技术的新发展。相信随着科技的不断发展，原生质体融合技术在遗传育种中会占有越来越重要的地位。 参考 文献 1 甘志波 . 黑曲霉 AS 一 1l原生质体的制备 J.湖北农业科学 ,1994,23(3):32 34. 2 林稚兰 ,黄秀梨 .现代微生物学与实验技术 M.北京 :科学出版社 ,2002:101102. 3 罗立新 .细胞融合技术与应用 M.北京 :化学工业出版社 .2004： 70 一 88. 4 OkadaY. I Microsc
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