1、毕业论文 文献综述 生物 工程 微卫星技术（ SSR） 及其对海洋生物的遗传研究进展 摘要： DNA 简单重复序列从 1974 年在海洋生物中被发现 ,到 1989 年 “ 微卫星 ” 术语开始使用这段时间是这种新型分子标记技术的发展阶段。伴随着 PCR 技术的发明、成熟与拓展 ,微卫星 DNA 以其多态性高、随机分布、共显性遗传、重复性好等特点在生物学的个体及系统发育方面得到很广泛的应用。本文详细地介绍了如何运用微卫星 DNA分子标记 的基本原理及方法 ,对不同壳色花纹文蛤进行遗传分析， 然后概括了在海洋动、植物的遗传学中 ,微卫星 DNA 在遗 传多样性分析、遗传图谱构建、基因鉴定和标记以
2、及系谱认证等领域的研究 ,展望了其在海洋生物分子育种、基因克隆、生物保护等方面的应用前景。 关键词： 分子标记 ； 微卫星 DNA； PCR技术； 遗传多样性 ； 遗传图谱。 近年来 ,微卫星作为一种分子标记 , 已成为种群研究和进化生物学最常用的分子标记之一 ,广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图谱、种群遗传多样性、系统发生等研究领域。 1 1 微卫星 DNA分子标记的基本原理 微卫星是指以少数几个核苷酸 (多数为 2 6个 ) 为单位的多次串联重复的 DNA 序列 ,如 (CA/ GT)n 、 (A G/ TC) n等 (n 为核心基本序列重复次数 )， 亦称简单重复序列 ( simple
3、 sequence repeats ,SSR)、短串联重复 ( short tandem repeats , STR)、简单序列长度多态性( simple sequence length polymorphism ,SSL P)等。在基因组中 ， 微卫星座位一般是由核心序列和两侧序列组成的。其中 ,微卫星 DNA 核心序列重复次数的增加或减少 ， 即微卫星 DNA 长度的变化 ， 是产生其多态性的根源 ， 从而导致微卫星核心序列突 变率相对较高 (10 - 5 10 - 3 )， 而每个微卫星座位的两侧一般是相对保守的单拷贝序列。微卫星 DNA 标记的筛选 ， 关键是要了解微卫星座位两侧的核苷
4、酸序列 ,寻找其中的特异保守区以设计引物。具体操作过程包括 DNA文库的构建 ， 含微卫星 DNA克隆的筛选、鉴定和测序 ，也可以通过 Gen Bank、 EMBL和 DDBJ等 DNA序列数据搜索微卫星序列 ， 再根据微卫星两侧序列在同一物种内高度保守的特性 ， 设计一对特异性引物来扩增微卫星序列 ， 后经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色 ， 通过谱带相对迁移距离的比较 ， 便可知某个微卫星座位 上的多态性。 2 2 微卫星 DNA分子标记的主要步骤 微卫星标记的实验步骤简便易行 ,主要包括微卫星的获得、微卫星引物的设计、 PCR扩增和产物的检测。 12 2. 1 微卫星位点的获得 主要有两种方
5、法 :包括经典的分子克隆法和现代的磁珠富集法。这两种方法都是首先构建小片断基因组文库 (一般为 150 500 bp) ,经典的方法是利用同位素标记 ,磁珠富集法用生物素标记的重复寡核苷酸作为探针对文库进行筛选 ,一般说来 ,应该根据不同的物种设计不同的重复寡核苷酸来筛选阳性克隆。根据得到的阳性克隆进行测序 ,就可以得到微卫星序 列 ,进行引物设计及研究分析。也可以通过构建 cDNA文库 ,克隆后对克隆载体直接进行测序分析 ,由于无效等位基因的存在 ,使得一些获得的微卫星位点偏离孟德尔遗传 ,因此 ,在使用微卫星标记之前 ,应先检测其孟德尔遗传形式 ,去除无效等位基因。 2. 2 引物设计及
6、PCR扩增 7 微卫星的引物长度一般为 18 24 bp,退火温度为 50 58 ,遵循引物设计原则 , G + C含量应在 45%以上。设计引物可以应用 Primer5. 0进行设计 ,也可以直接利用已发表的相关引物。由于不同的引物需要不同的反应条件 , 因此 ,应首先摸索 最佳的反应条件 (如模板浓度、退火温度和酶的用量等 ) ,再进行 PCR扩增。 2. 3 扩增产物的检测及分析 微卫星的扩增产物可以通过几种方法进行检测 ： 一是用约 3%的琼脂糖或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 , EB染色 ； 二是用 5% 7%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,进行银染 ,凝胶成像仪进行照相分析 ； 三是通过自
7、动化 DNA分析仪进行检测。通过生物信息学软件进行分析。 3 微卫星标记的特点 12 3.1 共显性遗传特性 与其它遗传标记 (如 RFLP、 RAPD等 )不同 ,微卫星标记表现为共显性遗传特性 ,即对来自亲本双方的等位基因型可以 同时表现出来 ,因而可以用于杂交子代的鉴别等。 3.2 数量多、分布广泛而均匀 Hamada等指出 ,在人类基因组中 ,平均每 10 50 kb片段有一个微卫星位点。微卫星广泛分布在基因组中 , 除染色体的着丝粒及端粒区域外 ,染色体的其它区域广泛分布微卫星。 3道指出 , 有大量的微卫星位于蛋白质的转录区 , 包括蛋白编码区和表达序列标签区。但这些区域的微卫星数
8、量是有限的 , 一般 20%。 3.3 多态性丰富、杂合度高、通用性好 微卫星分子标记的一个显著特点是高度的多态性 ,经常是一个微卫星位点具有多个等位基因。形成高 多态性的机理目前比较公认的理论是 “ 滑动错配 “和姐妹染色体的不等交换。一般说来 ,一个微卫星 DNA的核心序列重复数越高 ,其等位基因数越多 ,即多态性越高 8。如 Launey等 9牡蛎微卫星的平均等位基因数要比同工酶的等位位点丰富得多 ,杂合度也比同工酶高很多。微卫星的侧翼序列在不同物种中具有很高的保守性 ,而近缘物种间的序列相似性高 ,因此在设计引物时 ,在不同的科、属、种间有时可以通用 ,因而提高了微卫星标记的应用效率。
9、 3. 4 扩增反应所需模板量少 ,重复性好 可以从更多的材料如毛发、粪便、精细胞、微量的血液、牙齿 、骨骼和标本甚至非损伤样品中提取模板 ,获得微量 DNA。特别是对那些濒危的或只能非损伤性取样而又缺乏遗传关系信息的群体的分析 6具有了理想的分子标记应具备的特点 ,是一种比较好的分子标记。 4 微卫星 DNA分子标记在 海洋生物遗传学 中的应用 13 迄今为止 ,微卫星标记技术在重要海洋经济动物如虹鳟、大马哈鱼、平鮋、鰕虎鱼、西大西洋笛鲷、紫贻贝 11、牙鲆、日本鯷等已经得到广泛的应用 ,成为品种鉴定、遗传距离分析、群体遗传学等研究领域中的一项重要技术。在微藻及大型海藻如绿藻门、褐藻门、红藻
10、门、甲藻门和硅藻门等少数物 种中也筛选出微卫星标记 ,并应用于种质鉴定、种群遗传结构等方面的分析。 4.1 遗传多样性分析 基因杂合度又称遗传多样性 (genetic diver sity) ,一般认为它是度量种群变异的一个最适的参数 ,平均基因杂合度的大小近似地反映出遗传结构变异程度的高低。 Powell 等指出微卫星比其他分子标记如 RAPD 和 RFL P 等更能揭示遗传多样性。 David 等通过实验分析表明 ,微卫星比当前所有的分子标记都能够带来更多的信息。海洋生物遗传育种的一个前提就是要知道育种群体的遗传变异大小 ,从而制定出科学的育种措 施 ,防止遗传背景相似品系交配所造成遗传多
11、样性的丢失、子代杂合度降低和等位基因频率发生变化 ,特别是稀有等位基因的丢失。因此 ,微卫星在种群杂合度上的更加精确和高效性估测 ,不但为种质资源的调查和保护提供依据 ,也为遗传育种提供更科学的保证。 同时 ,还可以采用微卫星标记来鉴别不同种群尤其是亲缘关系较近种群间的遗传距离 ,绘制系统发育树 ,进行种质资源的评估和鉴定 ,并用于基因定位和分子标记辅助育种。 4.2 遗传图谱的构建 随着分子生物学实验技术的快速发展以及微卫星的高度自动化定型和测序的应用 ,不同物种越来越多的微卫星也不 断被检测出来。微卫星的高度变异性、在整个基因组中均匀分布、共显性遗传及易于分析等特点使其成为构建完整基因组连
12、锁图谱的最佳选择。在一些物种中 ,由于遗传背景差 ,在利用 RFL P 作图时 ,往往需要采用多次杂交甚至亚种间杂交的方法 ,以便得到双亲间等位基因的差异。而利用微卫星作图时 ,极易获得双亲间等位基因的差异 ,使得微卫星在遗传图谱的构建上极具诱惑力。 在农作物中 ,科学家们已经将微卫星标记添加到了大豆、大麦、水稻、玉米等以 RFL P 为基础的连锁图上。同样 ,在一些海洋经济动物中 ,如罗非鱼、虹鳟、鲶科鱼类和长牡蛎等 ,也 已经利用微卫星标记构建了遗传连锁群图谱。与这些农作物和海洋经济动物相比较 ,大型经济海藻的遗传育种还处于初级阶段 ,目前在大规模养殖中主要依赖于自然种群。因此 ,在我国特
13、有的重要海产养殖藻类如坛紫菜等 ,绘制出与重要经济性状如生长速度、高蛋白、抗病性等相连锁的遗传图谱 ,对于品种选育、种系评估都具有重要的意义。 4.3 贝类种群遗传选育研究中的应用 微卫星作为一种相对简单实用的 DNA分子标记技术 ,已经成为农业生物技术研究的一个热点之一 ,但在水产领域特别是贝类种质资源和遗传育种方面的研究刚刚起步 ,在贝类生物遗传多样性研 究、遗传育种及杂交鉴定等方面取得进展。利用微卫星标记的共显性特点 ,寻找与优良的性状相连锁的基因 ,进行基因定位 ,建立 QTL连锁图。利用微卫星标记的多态性特点 ,区分和鉴定同一种贝类的不同地理种群。在双壳类贝类中杂种优势现象普遍存在
14、,也是贝类遗传育种的一个重要研究内容 ,但是 ,由于大多数贝类具有偏母遗传现象 ,很难从表形上鉴别杂交情况 ,通过微卫星分子标记技术 ,对父母本及子代的微卫星基因型进行分析 ,甚至可以对受精几个小时后的受精卵进行检测 ,直接鉴定杂交的成功与否 ,加速杂交育种研究的进程。 12 5 展望 微卫星分 子标记的问世和发展为海洋生物定向遗传操作和品质改良提供了可能 ,成为分子生物学和海洋生物遗传学研究中的有力手段。微卫星 DNA 技术是基于 PCR 的方法 ,实验进程快速高效 ,结果稳定可靠 ,若结合 AFL P标记技术 ,一定可以构建饱和的遗传图谱 ,以弥补 RFLP多态性低、在育种上难以利用等不足
15、。 微卫星可以加速获取重要基因的进程 ,微卫星与集群分离分析法 BSA ( bulked segregant analysis ,简称 BSA) 结合 ,可以找到与目的基因紧密连锁的分子标记 ,定向克隆某些重要基因。因此 ,微卫星标记也将是克 隆基因的有效捷径之一。在育种工作中 ,微卫星技术若与传统的育种程序相结合 ,必将大大加快育种进程 ,很可能成为商业育种中尽快取得经济效益的一种技术。 微卫星标记是共显性标记 ,其优点是适用数量性状位点 (QTL) 定位研究 ,便于在育种中对相关的 QTL 遗传动态进行跟踪 ,从而大大增强人们对数量性状的遗传操纵能力 ,提高对数量性状优良基因型选择的准确性
16、和预见性。 另外 ,微卫星在其他领域 ,比如物种演化过程、杂种优势预测、濒危物种保护等 ,都有实际的应用。尽管微卫星标记在初始开发阶段耗费较大 ,但开发工作一旦完成 ,将永远受益。 13 参考文献： 1 Goldstein D B, Pollock D D. Launching microsatellites: a review of mutation processes and methods of phylogenetic interferenceJ. Hered, 1997, ( 88) : 335-342. 2 方宣钧 ,吴为人 ,唐纪良 .作物 DNA 标记辅助育种 M.北京 :科学
17、出版社， 2001,16. 3 Hiroshi H, Marianne G, Petrino, et a l. A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes J . Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1982,(79): 6465-6469. 4 魏东旺 , 楼允东 , 孙效文等 . 鲤鱼微卫星分子标记的筛选 J. 动物学研究 ,2001,22(3):238-241. 5 徐鹏 ,周岭华 ,相
18、建海 .中国对虾微卫星 DNA的筛选 J.海 洋与湖沼 ,2001,32:255-259. 6 李霞 , 白俊 杰 , 吴淑 勤等 . 剑 尾鱼微卫星 DNA 的筛选 J. 中 国水产科学 ,2004,11:196-201. 7 刘萍 ,孟宪红 ,孔杰等 .中国对虾部分基因组文库构建和微卫星序列的筛选 J.高技术通讯 , 2004 ,14 (2): 87-90. 8 Ma ZQ. Frequencies and sequence characteristics of ditriandtetra nucleocide microsatellite in wheat J. Genome , 199
19、6,(39) : 123-130. 9 Schafer R , Zischler H , Birsner U. Optimized oligonucleotide probe for DNA fingerprinting J . Elect rophoresis , 1988 , 9: 369-374. 10 Sarkar G, Paynton C , Sommer S S. Segment s containing alternating purine and pyrimidine dinucleotides : patterns of polymorphism in humans and prevalence throughout phylogeny J . Nucl Acids Res ,1991 , 19 : 631-636. 11 李莉 .长牡蛎的分子标记筛选和遗传图谱构建 D.中国科学院海洋研究所博士论文 ,青岛 . 2003 :129. 12 刘芳 ,刘卫东 ,王强等 .微卫星标记及其在贝类 遗传选育 研究中的应用 J.水产科学 ,2006,25(5):269-270. 13 胡则辉 ,周志刚 .微卫星 DNA标记技术及其在海洋生物遗传学中的应用 .海洋湖沼通报 ,2006,4:14-34.
