1、1 毕业论文 文献综述 生物 工程 原生质体融合技术的方法与影响因素 摘要 ：原生质体融合技术 被 广泛的应用于生物学、遗传学、医学免疫学、以及食品、农学等 各个 方面 。此技术不仅能克服远源杂交产生的障碍，还能使不同的优秀基因导入同一细胞，更成为改良生物的有力工具。文章就原生质体制备、融合及其再生过程中的方法及影响因素做了综述。 关键词 ：原生质体融合；影响因素；融合方法 前言 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工的方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞 的过程 1。原生质体融合技术起源于 20 世纪 50 年代。自
2、Weibull 利用溶菌酶首次得到巨大芽孢杆菌的原生质体之后 , Eddy 等利用蜗牛酶获得酵母菌原生质体的报道也相继出现。 70 年代 , Kao 发现聚乙二醇 (PEG)在钙离子 (Ca2+ )存在的条件下 , 能促使植物细胞的原生质体融合 , 并提高融合率 ; 此后原生质体融合技术得到了快速的发展。 20世纪 80 年代初 , Zimmermann 等报道了电诱导细胞融合的新技术 , 后来又发展了电磁融合法、激光融合法等技术 ,使原生质体融合技术在微生物育种方面形成一个系统的 、成熟的实验体系。如今原生质体融合技术已成为工业菌株改良的重要手段之一，并在农业、医药、环保等领域取得了开创性的
3、研究成果，而且应用领域不断扩大 2。 微生物原生质体融合技术整个过程包括：原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生 2。 1 原生质体的制备 将单倍体细胞接种于液体完全培养基中活化 , 然后离心收集菌体 , 悬浮于乙二胺四乙酸 (EDTA)或巯基乙醇中 , 振荡处理一段时间 , 使菌体细胞壁中的交联键松动 , 对酶的敏感性增加 , 再离心收集菌体 , 加入高渗酶液酶解 , 一般的高渗酶液配比为 1% 2%蜗牛酶 + 17%的蔗糖或山梨醇。随着酶解时间的延长菌体去壁程度更加完全 , 表现为原生质体形成率逐渐上升 , 当达到一定时间后 , 绝大多数的细胞已形成原生质体 , 再进行酶解会使原生质体
4、的质膜受到损伤 , 造成原生质体的失活 , 使再生率下降 , 因此必须选择合适的酶解时间 3。 2 原生质体的制备 影响因素 2 2.1 培养基成分对原生质体制备的影响 用酶分解微生物细胞壁，首先要培养菌体或菌丝体。菌体生长的培养基对原生质体化有明显影响，并且这种影响视微生物而异。原生质体化前在培养基中加 入某些物质阻止细胞壁的合成，可以提高酶解的效果。 2.2 酶系和酶浓度对原生质体制备的影响 利用酶分解细胞壁，由于各菌种细胞壁的成分和结构存在差异，因此不同的菌株所用酶的种类和浓度都有很大差异。酶的种类、浓度是制备原生质体最关键的因素。 2.3 酶解时间对原生质体制备的影响 酶解时间的长短直
5、接影响原生质体化的效果处理时间过短，脱壁不完全；处理时间过长，会导致原生质体脱水皱缩，再生率显著降低。 2.4 温度对原生质体制备的影响 不同的酶均有各自的最适酶解温度。酶解时温度选择的原则是既有利于原生质体化，又能防止 原生质体被破坏。细菌的最适酶解温度一般为 35 37oC 或 42oC，真菌的最适酶解温度为 30 50 oC，放线菌的最适酶解温度为 28 37 oC。 2.5 pH 值对原生质体制备的影响 酶解时的 pH 值随酶和菌种有一定的差异，需根据实际情况对 pH 值进行优化。 pH6.0对菌种 S-37 原生质体制备有利。而实验证明， pH4.5 鲍菇的原生质体制备率最高 4。
6、3 原生质体融合的方法 3.1 PEG 结合高 Ca2+诱导法 聚乙二醇 (PEG)是一种多聚化合物，不同种类微生物对 PEG 分子质量的要求不尽相同。放线菌适用分子 质量常为 1ku 1.5 ku，也有人使用 0.4ku 6 ku，真菌一般采用 4 ku6 ku，细菌用 1.5ku 6ku。亲本原生质体制备好后，即可进行融合。关于促融机制，一般认为 PEG 本身就是一种特殊的脱水剂，它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用，进而改变质膜的流动性能，降低原生质膜表面势能，使膜中的相嵌蛋白质颗粒凝聚，形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层区。在 Ca2+存在下，引起细胞膜表面的电子分布的
7、改变，从而使接触处的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到 两个原生质体全部融合 5。 3.2 电融合法 电融合技术是利用直流或交流电场的作用 ,迫使两亲本原生质体融合。包括下述过程；细胞在电场中极化成偶极子 , 沿电力线排列成串珠状； 两极间的高压电脉冲击穿紧密接触的细胞质膜 , 在细胞膨压的作用下完成融合。其优点是 : 融合频率高 , 对细胞3 无化学毒害 , 可在显微镜下观察融合全过程 ; 还具有空间定向、时间同步可调控的特点由于对设备的依赖程度较大 , 电激时间、电压梯度、交变频率等条件不易摸索 , 自 80年代初发明以来 , 一直难以推广。在酵母菌原
8、生质体融合中 ,汪和睦 6、张博润 7、程东升等 8曾利用电融合法成功地进行了啤酒酵母的融合。 3.3 激光诱导融合法 利用激光束对相邻两个细胞接触区的原生质膜进行穿孔 , 使两个细胞的基因进行交换重组。目前利用这种方法诱导动、植物细胞的原生质体融合已有大量报道 , 但用于酵母菌原生质体融合报道较少 3。 4 影响因素 4.5 融合剂 PEG 对原生质体融合的影响 仅将原生质体混合在一起融合频率并不高，需要添加 PEG（聚乙二醇）提高融合率。PEG 的相对分子量和浓度高低对融合都有较大影响。 PEG 的浓度一般为 30% 50%，浓度过高会 导致原生质体皱缩甚至中毒，过低导致原生质体破裂。 4
9、.6 融合时间和温度对原生质体融合的影响 PEG 处理时间是融合的最关键因素之一，尤其是对高 Ca2+和高 pH 值溶液处理时，时间长短非常重要。 PEG 溶液加入后，原生质体间即强烈地发生黏着，融合能长时间有效进行，因此 PEG 处理的时间常很短。融合处理时间 1 60min，大多数情况下为 110min。由于 PEG 有一定的毒性，处理时间过长，会导致原生质体失活。 5 原生质体的再生 酶解去壁后的原生质体应具有再生能力 , 这是原生质体融合育种的必要条件。尽管原生质体具有生 物活性 , 但它不是正常的细胞 , 在普通培养基平板上不能正常的生长、繁殖 , 必须加入渗透压稳定剂。影响原生质体
10、再生因素主要有菌种本身的再生特性、原生质体的制备条件和再生条件等。尤其是原生质体制备时的酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大 9。 6 影响因素 6.1 培养基对原生质体再生的影响 再生培养基的组成对原生质体的再生影响相当明显，培养基中碳源会影响微生物原生质体的再生率。在菌体生长培养基中添加适量的某些营养因子可有效提高再生率，常用的有蛋白质、氨基酸、水解酪蛋白、琥珀酸钠等。这些物质可作为细胞壁合 成的前体物质，也可通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢、加速细胞壁合成的作用。此外，二甲亚砜、 CaCl2、灭活的杆菌或某种菌体细胞壁提取物，也有利于原生质体细4 胞壁的再生，如法国的 S
11、vchaelle 在再生培养基中加入大肠杆菌细胞壁制剂或热灭活大肠杆菌细胞壁浓缩液，可使细菌原生质体再生频率提高 10 倍。 6.2 酶解浓度和时间对原生质体再生的影响 酶解浓度和时间不仅仅影响原生质体制备，而且还会影响到原生质体再生。酶浓度过高，时间过长，细胞壁完全去除，可以有效提高原生质体制备率。但细胞脱壁太彻底，必然会影 响原生质体的再生率。有文献报道，制备原生质体时保留少量细胞壁，会使细胞再生率大幅度提高。 7 前景及展望 原生质体融合技术在生产实践中的应用产生的效益，已是举世瞩目，它已成为高新技术开发的重要领域。在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等
12、方面都有广泛的应用价值。 参考文献 1 赵志强 ,郑小林 ,张思杰等 .细胞融合技术 J.生物学通报 ,2005,40(10):40 41. 2 朱河水 ,刘记强 ,杨国宇等 .原生质体融合技术的应用 J.安徽农业科学 ,2007,35(5):1312 1326. 3 彭帮柱 ,岳田利 ,袁亚宏等 .酵母菌原生质体融合技术 J.西北农业学报 ,2004,13(1):101 103. 4 郑重谊 ,谢达平 ,谭周进等 .影响微生物原生质体融合技术的因素 J.湖南农业科学 ,2006， (4):35 38. 5 王春平 ,韦强 ,鲍国强等 .微生物原生质体融合技术研究进展 J. 动物医学进展 .2
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