1、 毕业论文 文献综述 生物 工程 中华鳖雄激素受体 AR 基因克隆及其生物学的研究 摘要 ：中华鳖 (Pelodiscus sinensis)是我国重要的特种经济动物，其隶属于龟鳖目(Testudinata)、鳖科 (Triony-chidae)、鳖属 (Pelodiscus)中华鳖由于其独特的食用价值和药用价值得到广大养殖户的青睐 1，研究雄激素受体（ AR）基因克隆与表达等内容，在理论上丰富中华鳖生理学资料，在实践上为中华鳖的生殖调控和育种提供重要参考 2，为研究爬行动物性激素水平与免疫功能的关系提供形态学依据。本文 主要以中华鳖为实验对象， 对 AR的结构、功能及生物学信息对爬行动物的影
2、响 等 予以综述。 关键词： 中华鳖；雄激素受体；生物学信息 在雄激素属于类固醇激素，其生物学作用是通过特异的雄激素受体 (Androgen Receptor, AR) 介导的 3。雄激素主要是指辜丸 Leydig细胞合成、分泌的翠酮 (Testosterone, T)及其在靶细胞内的活性代谢产物一双氢辜酮 (Dihydrotestosterene， DHT)。雄激素的主要作用是在人胚胎期诱导男性内外生殖器的分化、青春期促进男性第二性征的出现及性成熟后 维持男性性功能和生育能力 4。 AR的缺陷可使靶细胞对雄激素反应性发生改变。目前己知与 AR缺陷有关的疾病有 :l.雄激素不敏感综合征 :2.
3、髓脊髓性肌萎缩 3.前列腺癌 雄激素结合在其受体上，作为一个转录因子来调控相关基因，进而发挥生物学功能。 1 AR 的起源与进化 1992年 Laudet等对不同的核受体进行系统分析表明，肾上腺受体和性类固醇受体区别于其他类型的核受体成为一个独立的分支。在这些分支中， AR、 PR、 GR、 MR属于一个亚类群； ER处于另一个亚类群。随着研究的深入， 1997年 Baker 和 Escrivaetal 研究发现 AR和 PR处于一个亚类群，而 GR 和 MR 处于另一个亚类群。另外， 1997年 Escriva等在真骨鱼类和鲨类发现了 AR、 ER、 GR、 PR 的祖先分子，在盲鳗 Par
4、amyxinenelsoni则发现了 PR，而在无脊椎动物却没有发现肾上腺受体和性类固醇受体。更有意思的是，他还在头索动物和尾索动物发现了雌激素相关受体，这就用实验支持了类固醇受体是一个近代的进化分支。接着，在 2001年 Thornton 等用七鳃鳗和所有已分离的类固醇受体构建的系统进化树表明， ER是肾上腺受体和类固醇受体的祖先， 并指出 PR起源于 ER 的复制和分化，而 AR 则来源于 PR的复制。 2雄激素受体的结构和功能 AR 属于核受体超家族 (Nuclear receptor super family)中的类固醇激素受体，是一种配体依赖型的转录因子。核受体家族成员在结构和功能上
5、都具有很高的相似性， AR 作为一种调节蛋白，一般有转录激活域 (NTD)、 DNA 结合域 (DBD)、和配体结合域 (LBD) 这 3个主要的结构域组成 5。 NTD作为变异最大的转录激活域，代表了大约一半的受体编码序列，介导了 AR的绝大多数转录激活活动，在物种或组 织特定功能的 AR能力激活上有非常重要的作用； DBD 作为进化上非常保守的蛋白质结构域，有着非常重要的作用。 DBD含有两个锌指结构。 N 端的第 1个锌指结构是被称为 P-box的基序 GSCKV，它可以特异性地与靶基因的雄激素反应元件 (Ardrogen response element， ARE)结合，从而启动基因的
6、转录。而第 2个锌指结构是被称为 D-box的基序 ASRND，它可以识别 ARE half-site之间的核苷酸距离并促 2使雄激素受体二聚体的形成； LBD位于 AR的 C 端，是一段高保守的域，活化 AR需要与相应的配体结 合，配体是指那些能够与受体特异性结合的生物活性分子。激素通过与雄激素受体结合，使雄激素受体分离出附属蛋白，转移至核内并且二聚化，刺激雄激素应答基因的转录。而在没有雄激素存在的情况下，雄激素受体没有活性，激素受体的 LBD区一般与热休克蛋白 (Hot shock protein， Hsp)结合。 3 AR的作用机制 睾酮、双氢睾酮等雄激素通过与雄激素受体结合而发挥作用。
7、雄激素受体无活性时与 Hsp 结合，当雄激素通过与受体结合，从而诱导 Hsp 解离，使 AR 发生一系列构象改变使其发生核转位，使 AR在细胞核内二聚 化，招募一系列共激活因子与 RNA聚合酶 等形成转录增强复合体，通过与靶基因启动子 DNA 反应元件结合，调控细胞的转录程序，从而激活细胞内相关靶基因的转录 6。4 AR 的组织表达模式 1990年 Takeda等采用单、多克隆抗体技术检测了人、小鼠和大鼠的 AR 的表达模式 , 结果显示 , 雌雄性生殖器官、肝脏、肾上腺、肾脏、心脏、骨骼肌、平滑肌、垂体前叶、前列腺、脑组织中均有 AR的表达 ,其中雌雄性生殖器官的表达量最高 ; 而脾脏是所检
8、测的组织当中唯一没有 AR 表达的组织。牛蛙的 AR 在脑、肝脏、肾脏、精巢、心 脏、小肠和指垫中均有表达。但是鱼类具有 2个不同基因编码的雄激素受体： AR和 AR。这是由于在进化过程中经历了一次特有的基因组复制。但是在 南方鲶的研究中发现， AR和 AR在脑、垂体、鳃、心脏、肝脏、肠、脾脏、性腺、肾脏和肌肉中都有表达。 5 AR 的作用过程 胞外分子伴侣复合物的形成： AR活化所需要的 LBD区的特定构象通过多分子伴侣复合物的组分与 AR不断的动态结合、分离，并使其稳定于某一特定构象，即部分折叠并能与配体高亲和力结合的构象 7,8,9,10。有研究表明， AR在核糖体上翻译的时候分子伴侣就
9、已经与 AR进行相互作用 11。在缺乏配体的情况下， AR分子伴侣复合物可以保持一种平衡，在此平衡中 AR始终处于具有高配体结合力的状态。配体一旦与 AR结合，结合在受体上的分子伴侣便有顺序地解离。 AR的转移及活化： 雄激素受体转移到核内是激素结合和 HsP90依赖的，并由核定位信号 (nuclearfocalizatinnsignal， NLS)介导。雄激素在细胞质内与 AR结合，使 AR磷酸化，并促使 AR改变构象形成二聚体。 HOP可以介导 HsP90/AR复合物沿着微管迁移至核仁附近，一旦 AR被活化， HOP/HSP90便介导 AR沿着微管逆向迁移，而 p50/HSP90复合物则能
10、介导 AR沿着微管顺向迁移。 HsP70也是一种在 AR移位过程中起重要作用的蛋白。在有激素存在的情况下， HsP70也是与 AR结合的，它可以暂时伸展 AR，使 AR顺利通过核内膜 12。 AR的降解： AR的降解一般发生在当其不能成功地转变为高配体结合亲和力构象的时候，这一过程是通过泛素一蛋白酶体途径完成的 10。其具体过程为：首先， AR磷酸化。其次，在 ATP供能的情况下，泛素与活化酶 El通过其 C一末端腺普化和随后的分子重排，形成分子内硫酷键而被活化， E1一泛素复合 体通过泛素结合酶 E2将泛素转移到AR赖氨酸残基的 e氨基基团上，并通过泛素蛋白连接酶 E3将第一个泛素分子连接到
11、 AR，另外一些泛素分子也相继与前一个泛素分子的赖氨酸残基相连，形成一条多泛素链。最终泛素化的 AR蛋白被 265的蛋白酶体逐步降解。随后，多泛素也被解聚为单个泛素，并参与重复循环。 6 本研究的目的和意义 中华鳖 (Pelodiscus sinensis)是我国重要的特种经济动物，其隶属于龟鳖目(Testudinata)、鳖科 (Trionychidae)、鳖属 (Pelodiscus)中华鳖由于其独特的食用 价值和药用价值得到广大养殖户的青睐 13。我们以中华鳖为研究对象，通过以 RT-PCR和克隆了中华鳖 AR 基因的 cDNA对其 AR 行了鉴定、功能以及进化的研究。应用生物信息学方法
12、，利用基因组和 EST数据库，在中华鳖中成功预测并克隆了 AR编码基因，并结合哺乳动物、软骨鱼以及两栖类等同源物种对它们进行了基因结构与分子进化等分析的生物学信息进行研究，为进一步研究中华鳖由雄激素受体参与的重要的生理功能奠定基础。 展望 雄激素是体内非常重要的类固醇激素，而雄激素作用的发挥必须借助其受体 -AR。AR的 NTD区是 AR活化的关键区域。这也是目前对于 AR研究的一个热点。随着人们对AR结构研究的日益透彻，对 AR 共激活因子和 AR下游基因的研究必将成为新的热点。而且随着研究的深入，一些和 AR相关的疾病也将得到控制甚至治愈。 参考文献 1 王海静，慕玉等 。 中华鳖抗菌肽
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