1、 毕业论文 开题报告 生物 技术 根酶原生质体制备因素及高蛋白酶菌株筛选 1.课题研究意义及国内外研究现状 根霉在自然界分布很广，用途广泛，其淀粉酶活性很强，是酿造工业中常用糖化菌。我国最早利用根霉糖化淀粉（即，阿明诺法）生产酒精。根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸，还能产生芳香性的酯类物质。根霉亦是转化甾族化合物的重要菌类。与生物技术关系密切的根霉主要有黑根霉、华根霉和米根霉。 本实验的研究是原生质体融合技术的基础，同时也是关键的步骤。在此技术上对根霉融合后的后代进行再生培养，并进行形态观察、酶活检测和蛋白质的 SDS 电泳，对结果进行分析并于亲本对照，观察后代和亲本的相同之处和不同之处。通过
2、原生质体融合使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程，起源于 20 世纪 60 年代。 1960 年法国的 Karski 研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。同时 ,日本的Okada 发现并证明了仙台病毒可诱发内艾氏腹水癌细胞彼此融合 ,从而开始了细胞融合的探讨。这项技术在高等动植物方面应用较早也很多 ,在微生物育种方面则起步较晚 ,但近年来国内外利用这项技术培育微生物良种比较活跃 ,在 方法上也有所进展。是一种新的有效的选育出优良品种的方法。 理论上讲体细胞杂交可在包括种内、种间、属间、科间甚至是界间的任何原生质体间进行
3、，原生质体融合技术不仅可以突破物种间的生殖隔离，创造远缘杂种；同时还可以使双亲的细胞质基因结合在一起，从而达到改良由胞质基因控制的性状的目的。 现在对根霉的灭活原生质体二次融合后代进行进一步的研究，经人工培养多代后 ,观察菌株的形态特征、部分生理生化形态分析以及的分析，为得到品种更优秀的，有利遗传更稳定的，作用范围更广的后代作铺垫。 2.课题研究的主要内容、预期目标和研究方案 主要内容： 1 菌体培养基的制备、灭菌，亲本菌种的杂交。 2 杂交代多个后代菌株进行形态特征分析。 3 杂交代后代 1、 2、 3 蛋白酶活力、淀粉酶活力、 SDS 电泳。 预期目标 ： 1 获得根霉后代菌株进行形态生理
4、生化分析，了解后代遗传形态 2 获得根霉后代菌株进行蛋白酶活力、淀粉酶活力、 SDS 电泳，得出数据 与 各个菌株比较。 研究方案： 1 菌种的活化与扩大培养： YPD 培养基活化菌种， PDA 培养基扩大菌种。 将准备好的菌种在无菌室超净工作台上接种于马铃薯固体培养基上，浇制 2 到 3 个。将接种好的培养基倒置于 30 恒温 培养箱中黑暗培养 3-5 天。 2 菌落形态特征的观察 观察平板培养基上菌落蔓延状况、疏松程度，表面湿润或干燥，有无光泽，隆起形状 ,边缘的整齐度、大小、颜色等。 3 菌体形态特征的观察 显微镜观察菌种的形状及出芽方式。 4 蛋白酶活力测定 在超净工作台上用接种针挑取
5、（未诱变和 80%以上灭活的再生培养基上的菌落）每个菌落接种到 PDA 培养基上分离纯化，每个培养基放 3-5 个， 25 培养 24h。将分离后的菌种，用直径 2mm 的吸管戳 4 个小区域，每个菌落用接种针挑 3 个接种到酪蛋白培养基上 25 培养 24h 或 48h 观察透明圈大 小并计算蛋白酶活力。 3. 课题进度计划 2010 年 09 月 2010 年 10 月：阅读相关资料以及试验的前期准备 2010 年 10 月 2010 年 11 月：菌种原生质体制备融合 2010 年 11 月 2011 年 01 月：传代培养以及形态观察 2011 年 01 月 2011 年 04 月：提
6、取蛋白进行电泳 2011 年 03 月 2011 年 05 月：整理结果，撰写论文 4. 参考文献 1 Hopwood D A,Wright H M. Genetic recombination through protoplast fusion in StreptomycesJ.J Gen Microbiol,1979,111(1):137-143. 2 梁平彦 ,刘宏迪 .展青霉和产黄青霉的种间体细胞杂交 J.微生物学报 ,1982,22(3):248-256. 3 彭帮 ,岳田利 ,袁亚宏等 .酵母菌原生质体融合技术 J.西北农业学报 ,2004,13(1):101-103. 4 王燕 .热 -紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株研究 J.中国酿造 ,2008,19:42-44. 5 李立风 ,潘力 ,彭昶 ,叶燕锐 .基因组改组几株同源酱油曲霉的多 亲株电融合育种中国调味品2007,7:14-18. 6 芦志龙 ,吴冰 ,袁尔东等 .基因组改组技术及其在微生物育种中的应用研究进展 J.生物技术通报2008 增刊 7 王国良 .对小猿叶甲高毒力烟曲霉菌株的选育技术 J.中国生物防治 ,2008,24(2):182-185.
