1、毕业论文文献综述 食品科学与工程 酵母原生质体融合及研究进展 摘要： 对原生质体制备、融合方法、研究进展进行比较详细的介绍。 关键词： 酵母菌；原生质体；融合方法； 1 原生质体 原生质体融合也称为体细胞杂交，是“细胞工程”的一个重要内容。 始于 20 世 60年代，在遗传育种中的运用具有十分广阔的前景。 分自发融合和诱导融合 2 类。前者是指植物组织或细胞在用酶分离原生质体过程中发生的原生质体自然融合现象；后者是指分离原生质体以后，通过加入诱导剂或利用其他方法诱导不同亲本原生质体发生融合的过程 1。 原生质体融合技术具有许多 常规杂交方法无法 相比 的优点：由于 除去 了细胞壁，原生质体膜
2、容易 融合，即使没有接合、转化以及转导等遗传系统的作用，也能发生基因组的融合重组；融合没有 极 性，发生融合的是整个胞质与细胞核，从而使遗传物质的传递更为完善；重组率高， 因而容易 得到杂种 菌 ；存在着两株以上亲株同时参与融合并形成融合子的可能 2；打破分类界限，实现种间或更远缘的基因交流 3；它与目前使用的基因工程方法相比 不 需 要 各种高级的仪器设备和昂贵的材料 ，也不需要 实验菌株进行详细的遗传学研究 等。 2 原生质体制备 酵母细胞外围是一层细胞壁 ,总厚度约为菌体直 径的 1/7,主要由葡萄糖、甘露聚糖、蛋白质等组成 4。只有去除细胞壁 ,才能使原生质体游离出来，目前去壁的方法
3、,绝大多数采用酶解法 ,一般选用终浓度 1%2%的蜗牛酶。 酶解液的体积按照以下方法来换算：菌丝重量的 1.5 倍就是酶解液的量，酶解液为混合酶液，蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶以一定的浓度混合，用渗透压稳定剂配制而成。酶液的配置要现配现用：一是为了防止酶的失活，二是防止对量的估计不足而造成浪费。酶液的配置要在无菌条件下配置防止有杂菌的进入，从而影响实验的结果。加入混合酶液后将菌丝和酶液充分混匀，放入适当的温度、 转速为 100r/min 的摇床中酶解一定的时间。 酶解完成之后将混合液用四层滤纸（已紫外灭菌）过滤，接着将滤液装入 EP 管（已灭菌）以 6000r/min 离心 20min。之后取少许
4、上清液在显微镜下进行观察，如没有原生质体说明原生质体已经完全沉淀了。此时可以将上清液去除 ,即将酶液去除，酶液的去除要尽快，否则会使酶解过程过度，从而造成原生质体的破裂，影响原生质体的形成，然后用渗透压稳定剂悬浮原生质体。 (以上步骤都要在无菌的条件下进行，防止杂菌的进入，造成污染影响实验结果 。 ) 酵母菌原生质体制备一般取对数生长期的单倍体 细胞 ,此时细胞代谢活跃 ,生长率高 ,群体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致 4。 3 原生质体的再生 原生质体融合育种的必要条件：酶解去壁后的原生质体应具有再生能力。尽管原生质体具有生物活性 ,但它不是正常的细胞 ,在普通培养基平板上不能正常的
5、生长、繁殖 ,必须加入渗透压稳定剂。影响原生质体再生的因素主要有菌种本身的再生特性、原生质体的制备条件和再生条件等。尤其是原生质体制备时的酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大 5。 4 原生质体融合的方法 原生质体的融合方法经过改进和完善，已经比较成熟。最早是 1972 年 Carlson 等使用 NaNO3 法获得了郎氏烟草和粉蓝烟草的细胞杂种，这也是第 1 个植物细胞杂种。 1973年 Keller 和 Melchers 提出采用高钙和高 pH 值诱导原生质体融合。 1974 年 Kao 等首次提出采用 PEG 诱导原生质体融合，后来提出并相继完善 PEG 与高钙、高 pH 值相结合的
6、方法（也简称 PEG 法）。 1978 年 Melchers 等用 PEG 法获得了马铃薯和番茄的属间体细胞杂种。 1978 年 Zimmerman 等首次提出了电融合的概念， 1979 年 Senda 等发明了电场诱导融合的方法。目前广泛使用的方法是 PEG 法、电融 合法和激光诱导融合法。 4.1PEG 法 PEG（聚乙二醇）是一种多聚化合物，溶于水，具有一系列分子量，分子式H(OHCH2-CH2)nOH，不同生物对 PEG 要求不同，一般以 1000-6000 为宜。 PEG 法诱导融合的可能机制是： PEG 中醚键带负电，和带负电荷的原生质体相遇后，由于 Ca2+的作用使其形成共同的静
7、电荷，从而促进异源原生质体的黏着和接合，经过高 Ca2+高 PH 溶液清洗后， Ca2+和 PEG 都被洗掉，电荷平衡被破坏，使原生质体中的某些正负电荷连接起来，形成具有共同质膜的融合体。为了发挥 PEG 促进细胞融合的 效力，必须采用较高的浓度（ 25%50%），但 PEG 浓度过高也会因为细胞脱水而受到显著的破坏。该方法的优点：容易操作，不需要特别的仪器设备。缺点：原生质体聚团大小不易控制， PEG分子量、诱导液浓度等不容易掌握，且 PEG 对原生质体有一定的毒性，影响其再生，导致融合率不高。原生质体融合如图 16 4.2 电融合法 最早是由 Zimmermann 等及 Senda 等提出
8、电脉冲可诱导细胞的融合。其原理是在短时间高频交流电作用下，在活细胞的内部，诱导去极化，引起细胞聚集，延电力排列成串珠状，互相紧密接触，然后两极 的高压电脉冲击，引起细胞膜的穿透，在细胞膨压作用下迫使两亲细胞融合。其优点：融合频率高 ,对细胞无化学毒害 ,可在显微镜下观察融合全过程 ;还具有空间定向、时间同步可调控的特点。缺点：需要在专门的电融合仪和配套的房间里进行，设备费用昂贵。在酵母菌原生质体融合中 ,汪和睦、张博润、程东升等7-9曾利用电融合法成功地进行了啤酒酵母的融合。研究表明电脉冲、宽度、波形和个数等因素对质膜通透性有较大的影响。电融合设备和原理如图 26 4.3 激光诱导融合法 其原
9、理先让细胞或原生质体紧密贴在一起，再利用激光束对相邻两 个细胞接触区的原生质膜进行穿孔 ,使两个细胞的基因进行交换重组。目前利用这种方法诱导动、植物细胞的原生质体融合已有大量报道 ,但用于酵母菌原生质体融合报道较少 10。其优点：损伤小，毒性小。缺点：设备昂贵，技术难度大，融合率低，选择性差。 5 酵母原生质体融合研究进展 Hinnen 等 11 首次证实了酵母菌中的转化。他们在已掺入 Leu2+基因的嵌合细菌质校Co1 E1，用 PEG 诱导，在 Leu2-菌株的原生质体获得该质粒，证明完整的质粒被整合到染色体的不同点位上。 Gunge 等 12采用原生质体融合技术 ，把 DNA 致死质粒
10、pGKI 1和 pGKI 2 从乳酸克奋维酵母转移到啤酒酵母中， pGKI 能在啤酒酵母中自主复制和稳定存在，而且能与啤酒酵母自身 2-um质粒共存， pGKI 质粒的啤酒酵母细胞表现出相同的致死型。当用 EB 消除啤酒酵母受体菌细胞中存在的 pGKI 质粒时，致死因子和抗性因子也消失了，结果表明，致死因子和抗性因子位于 pGKI 质粒上。 pGKI 质粒转移的成功，为酵母菌分子生物学和遗传学提供了一个重要的依据。 参考文献 1王幼平 ,张莉莉 ,吴晓霞 .原生质体融合 J.生物学通报 ,2009 年 . 第 44 卷第 8 期 . 2 郝勃 .两株黑曲霉原生质体的形成和再生过程观察 J.华中
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