1、本科毕业论文（20 届）蛹虫草菌丝体液体培养条件的优化所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘 要蛹虫草，也称北冬虫夏草，具有补虚损、益精气、保肺、益肾、止血化痰、滋补强壮等功效，是我国的名贵中草药材。本论文采用沈阳微生物研究所提供的蛹虫草优质菌种，通过斜面培养、液体培养等过程，获得优质的蛹虫草菌丝体，并以菌丝体重量为指标，对培养温度、初始pH 值、培养箱转速、最佳碳源、最佳氮源、最佳无机盐等液体培养条件进行单因素长春工业大学毕业论文II分析，通过正交试验法确立了蛹虫草菌丝体的最佳培养基配方。实验结果表明，蛹虫草菌丝体培养最佳碳源是葡萄糖，最佳氮
2、源是蛋白胨，最佳无机盐是 KH2PO4 和MgSO4；最佳培养基配方是葡萄糖 20g/L，蛋白胨 10g/L，KH 2PO4 1.0g/L，MgSO 4 0.5g/L，V B1 50mg/L；最佳培养温度是 24，最佳初始 pH 值是 6.0，最佳培养箱转速时 150r/min；并在最佳培养条件下绘制了蛹虫草菌丝体生长曲线，其对数期为第57.5 天，菌丝体平均重为 7.07g，稳定期为第 7.59 天，菌丝体重为 14.63g，从第 9 天后，蛹虫草菌丝体开始衰退。关键字：蛹虫草；液体培养；正交试验法长春工业大学毕业论文IIIAbstractCordyceps militaris , also
3、 known as the North Cordyceps, has the effect of completing deficiency, benefiting the essence, lung and kidney, haemostatic and resolving phlegm, nourishing and strong, It is a precious Chinese herbal medicine materials.Cordyceps militaris in this paper has high quality and is provided by the Sheny
4、ang Institute of Microbiology. After taking slant culture and liquid culture processes, we get high quality Cordyceps militaris mycelia. It takes mycelium weight as an indicator to make univariate analysis of the incubation temperature, initial pH value incubator speed, the best carbon source, the b
5、est nitrogen source and the best inorganic salts liquid culture conditions. With orthogonal test method, its established the optimum mycelia medium. The experimental results show that the best carbon source for the mycelia is glucose, the best nitrogen source is peptone, the best inorganic salt is K
6、H2PO4 and MgSO4.A optimum medium includes glucose 20g/L, peptone 10g/L, KH2PO4 1.0g/L, MgSO40.5g/L,VB1 50mg/L.The optimal incubation temperature is 24, the optimal initial pH value is 6.0, the best incubator speed is 150r/min. The growth curve of Cordyceps militaris mycelia is drawn on the optimal c
7、ulture conditions. The logarithmic phase turned up at the 5th to 7.5th day, the mycelium average weighted 7.07g, the stabilization period turned up at the 7.5th to 9th day. The mycelium weighted 14.63g and the recession began from the ninth day.Keywords: Cordyceps militaris; Liquid culture; Orthogon
8、al method.长春工业大学毕业论文IV目 录摘 要 .IAbstract.II第一章 前 言 .1第二章 文献综述 .22.1 蛹虫草简介 .22.1.1 形态特征 .22.1.2 生长条件 .32.1.3 功能成分 .32.1.4 药用价值 .52.2 蛹虫草培养基的作用 .72.2.1 碳源 .72.2.2 氮源 .72.2.3 无机盐 .72.3 蛹虫草培养条件的影响 .72.3.1 初始 PH 值的影响 .72.3.2 培养温度的影响 .82.3.3 摇瓶转速的影响 .82.4 菌种液体培养及优化 .82.4.1 单因素试验法 .82.4.2 正交试验设计法 .82.4.3 响应
9、面优化设计法 .92.4.4 二次正交旋转组合法 .102.5 国内外研究现状 .102.6 本文研究意义 .12第三章 实验部分 .133.1 试验材料 .133.1.1 菌种 .133.1.2 培养基 .133.1.3 主要试剂 .133.1.4 主要设备 .133.2 试验方法 .143.2.1 蛹虫草菌丝体的培养 .14长春工业大学毕业论文V3.2.2 蛹虫草菌丝体培养基的优化 .143.2.3 蛹虫草菌丝体培养条件的优化 .163.2.4 蛹虫草菌丝体生长曲线的绘制 .173.3 结果与分析 .173.3.1 蛹虫草菌丝体培养基的单因素分析与正交试验结果 .173.3.2 蛹虫草菌丝
10、体培养条件的优化 .233.3.3 蛹虫草菌丝体生长曲线 .26第四章 结论与展望 .284.1 结论 .284.2 展望 .28致 谢 .29参考文献 .30长春工业大学毕业论文1第一章 前 言蛹虫草，又称北冬虫夏草，主要产自吉林、云南等地带的针阔叶林的鳞翅目昆虫蛹体上，是一种名贵的药用真菌。蛹虫草菌含有多种有效成分，包括核苷类化合物（又称虫草素） 、虫草多糖、虫草酸、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD） 、维生素及微量元素等7大类具有生物活性和药理作用的化合物 1。这些有效成分可以增强人体免疫能力，并具有抗癌、抗病毒等功效 2。目前市场上销售的冬虫夏草人工替代品主要是通过3类方法培育的蛹虫草菌
11、：1.用鲜或干蚕蛹体培植出的蛹与草为一体的“蛹体虫草” ； 2.以大米、小麦等为主要原料，在固态人工合成培养基上培植出的“虫草菌子实体” ； 3.采用液体深层发酵法培养的蛹虫草菌丝体。在药化、药理和临床试验 3均证明它们的主要有效成分可替代天然的冬虫夏草。对蛹虫草菌进行液态发酵培养大量生产菌丝体，比固态培养蛹虫草菌子实体具有周期短、可控性强、功能性有效成分含量高等优点，且利于大规模生产 45。液态深层发酵培养蛹虫草菌主要受培养基组成及培养条件的影响，培养基内碳源、氮源和无机盐等物质的成分与含量，培养条件的变化及其各物质间的相互作用对菌丝体生长和产量都有直接影响。因此，对蛹虫草菌优化培养不仅解决
12、了野生虫草资源缺少的问题，也开发了其药用价值，对以后的人类生活产生重大意义。本实验采用单因素法和正交试验法，对蛹虫草的液体培养基及培养条件进行了优化，目的是获得最大量菌丝体的培养基配方。长春工业大学毕业论文2第二章 文献综述2.1 蛹虫草简介蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种 6。学名为Cordyceps militaris，又称为北冬虫夏草，野生资源稀少。蛹虫草主要分为子座（即草部分）和菌核（即虫的尸体部分）两部分。虫体外形较完整，体内充实如僵死的老蚕，表皮呈深黄色至黄棕色，背部有横皱纹，腹部有八对足，以中间四对较明显，头部三对不甚清楚，尾部一对隐约可见。菌座细长，呈圆柱
13、形，直立或稍弯曲，上部膨大，表面深棕色至棕褐色，带有不明显的纵皱纹，质地柔韧，端面内心空虚，呈粉白色 7。冬季幼虫居住在土里，部分菌类寄生在幼虫体内，从其中吸取营养，使幼虫体内充满菌丝导致死亡。夏季从幼虫的尸体上生出幼苗，形状似草，夏至前后可采集得到。中医认为，虫草主要入肾肺二经，既能补肾阳，又能补肺阴，是唯一的一种能同时调节、平衡阴阳的中药。2.1.1 形态特征子座单个或数个从寄主头部或节部生出，颜色以橙黄色为主，一般不分枝，高35cm，子座头部呈棒状，表面粗糙，长12cm，粗35mm；子囊壳下部埋生于子座头部的外层，外露，近圆锥形；子囊线形，细长，大小为(400300)um(45)um，内
14、含8枚线形孢子，粗约1um，孢子细长，几乎充满子囊，成熟时产生横隔，并断成23um的小段；子座柄部近圆柱形，内实心，长 2.54cm ，粗24mm 8。蛹虫草菌丝体由子座单个或数个一起从寄生的蛹体头部或节部长出，颜色为橘红或橘黄色，全长28mm，蛹体的颜色变为紫色，全长约1.52mm。2.1.1.1 菌丝体蛹虫草的菌丝是一种子囊菌。当菌体成熟即形成子囊孢子，孢子随风传播，一旦落在合适的虫体上，便开始侵入形成菌丝体。菌丝体一边不断地发育，一边开始缓慢向虫体蔓延，导致蛹虫被真菌感染，菌丝体开始分解蛹体内的组织，吸收蛹体内的营养，为其生长发育提供足够的物质和能量，最后将蛹体完全分解。2.1.1.2
15、子实体通常当蛹虫草菌丝将蛹体内的各组织器官完全分解后，菌丝体开始进入发育新阶段发育。菌丝体由营养生长转为生殖生长，最后集结后从蛹体空壳的各部分伸出，形成呈棒状的子实体，一般为橘黄色或橘红色。见图2-1.长春工业大学毕业论文3图2-1 蛹虫草子实体 2.1.2 生长条件蛹虫草主要生长在高寒区，高山雪线附近，常于海拔4000m 以上的高山上出现，尤其多出现在积雪、排水良好的高寒草甸。最适分布海拔高度为42004600m ，下限是3000m，上限是5100m。产区的平均气温为0.28，年降水量556.7651.3 mm，气候具有明显的干季和雨季。在我国的分布主产于四川、西藏、青海、云南的高山、亚高山
16、草甸区，近年在辽宁也有发现 6,911。蛹虫草的生长需要适宜的营养条件，包括碳源、氮源、无机盐以及维生素，还需要适宜的温度，水分以及光照，酸碱度等。在菌丝生长过程和子实体成长过程需要不同条件，以保证生长最好。2.1.3 功能成分蛹虫草含有多种生理活性物质，迄今已检测或分离到多种活性物质如虫草素、腺苷、虫草多糖、虫草酸、超氧化物歧化酶(SOD) 以及矿物质元素等 12。（1） 虫草素虫草素又称虫草菌素，是Cuninghum等人于1951年从蛹虫草寄生的昆虫组织中分离得到的一种腺苷类活性物质，将其命名为虫草素，并确定其结构式为3-脱氧腺苷 1314，虫草素分子式为 C10H13N5O3，分子量为2
17、51 ，碱性，针状或片状结晶。陈尚卫等研究证明蛹虫草中含有虫草素，蛹虫草子实体中虫草素的含量约为0.053% 15；孙月等证明野生蛹虫草子实体中虫草素的含量略高于以大米为培养基的人工栽培蛹虫草子实体中的虫草素含量，以大米为培养基的人工栽培蛹虫草子实体中虫草素的含量高于其菌丝部位 1617。通过多项研究表明，虫草素具有多种功效。包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用，现已在白血病的临床治疗方面开发了新药，并成为虫草领域的研究热点。 （2）虫草酸 虫草酸即D-甘露醇( D-mannitol) ，有关虫草酸的研究证明，野生蛹虫草子实体中的虫草酸含量高于以大米为培养基的人工栽培蛹
18、虫草子实体，以大米为培养基的人工栽培蛹虫草子实体中的虫草酸含量高于大米培养基的菌丝部位，但低于深层发酵菌丝体中的虫草酸含量 16；江晓路等测得蛹虫草和冬虫夏草中均含有较高含量的虫草酸，而且在蛹虫草深层发酵菌丝体中，其虫草酸的含量大大高于天然虫草 18。相关研究表明，虫草酸具有抗自由基，抗氧化、利尿脱水、镇咳、祛痰平喘的长春工业大学毕业论文4作用，在临床上可用于血管痉挛、脑血栓、肾功能衰竭的治疗 19，是虫草的有效成分之一，常作为虫草及其制品的质量检测指标 12。（3）虫草多糖虫草多糖是蛹虫草中含量最多的药理活性物质，是一类高分子复合物研究者对蛹虫草粗多糖水溶液的理化性质进行分析，结果表明其具有
19、良好的耐热性、触变性、增稠性、抗盐性，以及对广泛P值的稳定性 2021。大量研究表明，虫草多糖有着多种生物活性功能，具有广泛的药理作用。主要具有免疫功效，抗放射作用。虫草多糖还具有抗病毒、抗疲劳、保肝、抗缺氧、抗流涎等多种功效 22。(4) 腺苷腺苷即腺嘌呤核苷，在生理代谢过程中起着调控作用，可用于治疗心绞痛、心肌梗塞、动脉硬化、原发性高血压及中风后遗症等病症，是虫草的主要活性成分之一，常用作虫草药材和深加工产品的质量检测指标 12。（5）超氧化物歧化酶超氧化物岐化酶(S0D)普遍存在于好氧生物体内，是生物细胞防卫系统中重要的一种抗氧化物酶，构成了细胞抗氧化损伤的第一道防线 23。 在真核生物
20、中主要存在3种SOD同工酶，包括细胞质Cu，Zn-SOD、线粒体 Mn-SOD、细胞质Fe-SOD 24。许多研究报道表明，丝状真菌的Cu，Zn-SOD具有潜在的额外修饰基团和多聚体 2526，可以为解决SOD 半衰期短以及体内给药的活性问题等缺陷提供更有效的 S0D药用蛋白。蛹虫草含有全部以上3种SOD同工酶，其中Cu ，Zn-SOD是一种中性蛋白，占总SOD的9O%以上，是蛹虫草体内主要的SOD 2728。张小强等采用邻苯三酚自氧化体系，研究了冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除作用，结果表明冬虫夏草和人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基均有清除作用 29。另有
21、相关研究表明，蛹虫草子实体中的SOD含量要高于冬虫夏草子实体中的SOD含量。(6) 其他活性成分除此之外，蛹虫草中的活性成分还有肽类化合物、甾醇类化合物等，研究者目前已经从蛹虫草中分离鉴定到谷甾醇、麦角甾醇等多种甾醇及其衍生物，其中麦角甾醇是脂溶性维生素D 2的前体，是真菌的特征醇，在蛹虫草中的含量相对恒定，具有防衰老、抗癌、减毒等作用 30。虫草中的氨基酸，维生素；无机元素等也是种类繁多，孟庆繁等的研究结果表明，蛹虫草中氨基酸的总量及人体8种必需氨基酸的含量较高，其含量与天然冬虫夏草基本相当，而且蛹虫草子实体中的氨基酸含量高于菌丝体 3132。此外，蛹虫草中还含有多种维生素,对蛹虫草功效的开
22、发起到了重要作用。长春工业大学毕业论文52.1.4 药用价值2.1.4.1 免疫调节作用蛹虫草的免疫作用主要与蛹虫草多糖有关，蛹虫草多糖在增强免疫能力过程中扮演着重要角色。研究表明，蛹虫草多糖的不同组分均能增加小鼠的胸腺和脾脏的重量，提高机体的体液与细胞免疫。蛹虫草具有促进T和B 淋巴细胞增殖作用，明显抑制小鼠脾细胞对刀豆蛋白A和细菌脂多糖的反应；减少小鼠特异抗体分泌细胞数；降低特种异型抗原诱导的迟发型超敏反应及混合淋巴细胞反应；来源于蛹虫草的新型免疫抑制剂FTR720 ，能直接作用于淋巴细胞，表现出免疫抑制效果，可抑制器官移植等的排斥反应 33。戴瑛等 34试验得出，蛹虫草提取物可调节小鼠机
23、体组织的免疫功能，可以缓解其由于内毒素或类似物质造成的肺部炎症。徐廷万等 35试验得出人工蛹虫草胞外多糖可增强免疫功能被抑制的非特异性免疫功能和体液免疫功能，还有抗疲劳作用。李义等 36试验证明口服虫草菌粉可显著地提高罗氏沼虾的免疫功能，有效地预防嗜水气单胞菌的感染。2.1.4.2 抗肿瘤作用蛹虫草可以抑制癌细胞发生裂变，并阻碍拖延癌细胞快速扩散，明显提高机体内T细胞和巨噬细胞的吞噬能力。蛹虫草多糖能够有选择地增加脾脏的营养性血液量，使脾脏重量增加，进而导致脾中的浆细胞明显增多，具有抗放射作用。蛹虫草多糖还能增加血清中的皮质酮含量，促进机体内蛋白质和核酸的代谢，具有一定的抑瘤作用。药理试验证明
24、，蛹虫草子实体可明显抑制S180瘤细胞 37，其抑制肿瘤的机理已被初步探明 38；美国1997年开始将虫草素用于I期临床试验，治疗急性前B和前T淋巴细胞白血病患者。除此之外，他还对人体黑色素瘤B16细胞、人体白血病HL-60细胞、人体红血病K562细胞具有较好的抗肿瘤效果，其效果要优于冬虫夏草 20。2.1.4.3 抗氧化、抗衰老作用桂仲争等人研究发现，蛹虫草提取物能有效防止D-半乳糖致衰老小鼠的多项衰老体征的出现，具有明显的延缓衰老作用，其作用机理可能与其提高抗氧化酶活性、清除自由基、减少过氧化脂质的生成有关。曹晶等人通过研究发现虫草酸具有促进人体新陈代谢，改善人体微循环系统，明显地降血脂，清除自由基，抑制细菌，增强对疾病的抵抗力等作用，蛹虫草通过对羟自由基的清除作用而保护肝脏。
