1、毕业论文 文献综述 生物工程 分子生物学技术应用于木霉菌鉴定的研究进展 摘要 ：木霉 (Trichoderma spp.)属于半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科的真菌。近年来，人们把分子生物学技术应用于木霉属的分类和鉴定研究中，开创了一个真菌系统分类学的新时代，并取得了显著的成功。本文综述了蛋白标记 (同工酶分析 )、可溶性蛋白电泳鉴定、核酸序列分析、通用引物 PCR分析 、 ITS PCR-RFLP 分析、 AFLP 分子标记技术、 RAPD标记等分子生物学技术应用于真菌鉴定的几种方法，为木霉菌类的种属鉴定提供了理论参 考。 关键词 ：木霉、分子生物学技术、应用、鉴定 木霉 (Trich
2、oderma spp.) 属于半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科的真菌其有性阶段为囊菌亚门，肉座目，肉座科的肉座菌属，全世界都有分布。广泛存在土壤、空气、腐烂的木材及植物残体等基质中，通常为土壤中微生物种群的优势组成，也是一种植物内生真菌，在海洋中也有发现 1,2。 木霉菌由于其在农业上的生物防治作用和通过发酵所产生的纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、几丁质酶及蛋白酶等，被广泛地应用于农业病虫害防治、食品、卫生、饲料、制浆、纺织、造纸、生物 基因工程和环保等领域，从而受到了广泛的研究和关注。此外，木霉菌个别种也可导致蘑菇生产污染，造成减产，也会引起动物，包括人类的免疫障碍疾病的机遇性病原菌，
3、还有些木霉菌还能通过与植物形成共生关系，来促进植物生长发育，诱导并激发植物自身免疫功能，但由于其在酶、抗生素及生防等方面有着重要的经济生产价值而得到世界广泛的研究和关注。木霉菌形态多样，种类繁多，功能各异，合理准确对其进行分类对于木霉菌的研究和利用有着重要的意义 1,3。 形态学分类是一种最基础也是比较成熟的方法，然而由于木霉菌株的形态复杂，培养特征又缺乏 稳定性，给木霉菌的种类鉴定造成困难，致使木霉的分类鉴定长期处于混乱状态 4。近年来，人们把分子生物学技术应用于木霉属的分类和鉴定研究中，开创了一个真菌系统分类学的新时代，并取得了显著的成功。本文综述了分子生物学技术应用与真菌鉴定的大多数方法
4、。 1 蛋白标记 (同工酶分析 ) 同工酶电泳是评估遗传变异的一个常用方法。 1985 年， Zamir 和 Chet 首次用同工酶特征模式来表示木霉菌种。根据同工酶特征， 23 株来自不同地区的哈茨木霉被分为了五个不同类型。分析结果表明，酶电泳可以在种间水平上进行木霉的鉴定。后来 Leuchtmann 等人根据同工酶分析的方法研究了包括T.longibrachiatum、 Hypocrea schweiniitzii、 H. jecorina Berk.&Broome 在内的 78个木霉代表菌株。结果证实了 Bissett建立的木霉分类体系是正确的 5。 2 可溶性蛋白电泳鉴定 60 年代以
5、来，许多报道表明可溶性蛋白质凝胶电泳在真菌类鉴定和分类方面是有效的。陈建爱，王未名等也利用可溶性蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳对 26个木霉菌株进行特征性图谱分析，发现种间蛋白质电泳图谱差异显著，种内菌株间基本一致，为木霉在 形态上分类提供可靠的辅助理论依据 6。肖性龙，杨合同等也同样对 61 株来自不同植物根际的木霉菌进行了可溶性蛋白质电泳分析，结果与陈建爱相同 7。 3 核酸序列分析 核酸序列分析是通过测定核酸一级结构中核苷酸序列的组成来比较同源分子之间相关性的方法，它能为物种提供最直接、最有价值及最为准确的信息，利用它不仅可直接地研究物种间的亲缘关系，而且对了解基因及其产物的结构、基因表达以及
6、分子进化等方面具有重要意义 8。 Druzhinina 等第一次将该理论应用到真菌的研究中，他们是在考察了木霉与肉座菌属 88个菌株的 979段序列，共计 135个 ITS1和 ITS2单元型序列的基础上研发出来的 14。 4 通用引物 PCR分析 通用引物 PCR (Univer sally Primed PCR,UP-PCR)是一种 PCR指纹图谱技术9，它是根据聚合酶链反应 (PCR)，用人工合成的一段 16bp以上的通用引物，对待研究的基因组 DNA进行 PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，形成 PCR 指纹图谱，利用扩增产物多态性进行物种鉴定及多样性分析。它类似于
7、RAPD(随机扩增多态性 DNA)技术，可用于基因组结构研究、物种鉴定 、种间与种内遗传关系分析以及种群多样性研究，将其与 SCAR(特异序列扩增 )标记技术结合使用，可用于监测释放到环境中的生防菌株 10。 5 ITS PCR-RFLP 分析 丁德娟，李世贵 11等采用 ITS PCR-RFLP 方法对供试 115 株共计 17 种木霉属菌株进行分析，首先通过 CTAB 法提取基因组 DNA，利用 ITS 通用引物对 ITS1/ITS4 扩增 ITS 区段，最后通过 HaeIII 和 HinfI 2 种限制性内切酶分别消化 ITS 区段。 ITS PCR-RFLP 共获得 17 条清晰易辩的
8、限制性酶切片段。其中， HaeIII 共切出 10 个条带，将供试菌株分为 12 种限制性酶切类型； HinfI 共切出 11 个条带，将供试菌株分为 15 种限制性酶切类型，因此后者的区分度较高。 HaeIII 和 HinfI 对 115 株共 17 个种有一定的区分能力，数量较多的种均有各自的代表酶切类型或特殊酶切类型，极个别种由于数量限制因而不好评判。 6 AFLP 分子标记技术 扩增片段长度多态性 (Amplified fragmentlength polymorphism， AFLP) 分子标记技 术是 1992年由荷兰科学家 Zabeau 和 Vos 发明的，并获得了欧洲专利。该技
9、术结合了 RFLP 和 PCR 的优点，具有灵敏度高、稳定性好和可靠性强等优点，被认为是目前一种十分有效、理想的分子标记手段，已广泛应用于生物多样性、基因定位、群体遗传结构及物种种质鉴定、分类和进化研究等方面。黄玉杰， PAUL Harvey等通过摇床培养的木霉菌丝为材料，采用液氮研磨等方法提取到高质量的基因组 DNA，能够用于 AFLP 实验分析，探索和优化酶切连接反应、预扩增和选择性扩增反应过程中的关键因素，建立了适合木霉 AFLP的最佳试验体系和反应条件。利用该技术体系对不同时期保存的菌株及融合子进行AFLP指纹分析，发现不同时期保存的同一菌株指纹相同，融合子指纹兼有亲本菌株的特性。通过
10、对木霉 AFLP 条件的探索和研究，建立了木霉基因组 AFLP反应体系，得到的扩增多态性条带完全能够用于木霉遗传稳定性和多样性分析 12。 7 RAPD 标记 随机扩增多态性 DNA(random amplified poly-morphic DNA,RAPD)技术是目前在真菌多样性分析中应用最为广泛的一种分子生物学方法之一。它是 建立于DNA和 PCR基 础之上的分子标记 ， 对于作物改良和多态性研究具有重要作用，与 AFLP、 RFLP相比，具有简单快速， DNA需要量小等优点 13。 其基本原理是应用随机引物对目标基因组 DNA 进行 PCR 扩增 ,经电泳分离，扩增产物所呈现的不同条带
11、图谱，反映了基因组相应区域的 DNA多态性 14。唐嘉义，王家和等对对 6种木霉分别进行拮抗活性测定和随机扩增多态性 DNA(RAPD)；其结果显示 6种木霉对 4种植物病原菌均有不同程度的拮抗性； 6种木霉 DNA扩增谱带差异明显，遗传相似性聚类分析结果按一定遗传距离可分 6群；与形态分类结果一致，可作 为木霉分类鉴定的依据 15。 8 小结与展望 随着核酸测序技术的普及及各种分子标记方法的不断完善与发展，在微生物研究领域中，对于微生物的鉴定已经从依赖于传统的形态学及生理生化鉴定的时期逐步过渡到依靠分子生物学手段进行种质鉴定与系统发育分析的研究阶段，但这并不能取代传统的鉴定方法，而是对生理生
12、化及形态学方法的补充。尽管木霉及其有性型的分类学和分子系统学研究已取得了很大的进步，但是对木霉的组、种间的亲缘和演化关系还没有得到最终解决。此外，分子生物学鉴定的结果有时与传统的形态学分类结果不一致，要最终建立木霉的自 然分类系统还有许多工作要做。然而随着木霉研究的不断扩展和深入，相信会有更多木霉菌被筛选，进而丰富木霉种群及其系统分类学研究，更为筛选优良菌株或利用基因工程技术和原生质体融合技术，构建高产高效木霉菌的生防菌株防治植物病害、环境保护等提供有力的保障。 参考文献 1 张广志 ,杨合同 ,文成敬 .木霉菌形态学分类检索与分子生物学鉴定 J.山东农业大学学报(自然科学版 ),2011,4
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