1、毕业论文 文献综述 生物工程 宁波典型排污口 7种细菌丰度调查 摘要： S元素转化细菌在硫元素循环中发挥了重要作用 ， 主要有硫化细菌和硫酸盐还原细菌 。 目前我国硫污染的问题日趋严重 。 许多应用领域都迫切需要进行硫污染的治理。故此，我们需要对硫元素转化细菌的检测方法和分布应用进一步的进行研究，并提出了几点展望。 关键词： 硫元素转化细菌 ； 硫循环 ； 研究方法 ； 种类 ； 分布 硫化细菌和硫酸盐还原菌（ SRB）是推动硫循环的重要微生物。硫化细菌能把还原性硫化合物氧化为硫酸盐，缓解土壤中硫化物的积累；硫酸盐还原菌能把硫酸盐还原为硫化物 ，同时消耗土壤中的有机物质，它们共同维持硫循环的动
2、态平衡。 硫化细菌（ thiobacillus）氧化还原态硫化物（ H2S、 S2O2-3）或元素硫，获得能量，同化二氧化碳。在矿山的水坑中，硫化细菌可使金属硫化物氧化成硫酸，使矿物中的金属被溶解，对低品位铜矿等矿物的开采具有重要意义，被称为细菌浸矿 1。硫化细菌在土壤中的活动，能提高土壤各种矿物质的溶解性，同时能抑制某些对酸敏感的病原菌的生长。某些土壤中施用硫磺，可通过促进硫化细菌的活动提高土壤酸度，从而改良碱性土壤。此外，硫化细菌的氧化作用也为植物提供了可利用的硫酸态硫素营养。 硫酸盐还原细菌 SRB（ Sulfate-reducing bacteria,SRB）是一类以乳酸或丙酮酸等有机
3、物作为电子供体，在厌氧状态下，把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等还原为硫化氢的细菌总称 , 对废水中硫酸盐的去除具有重要的意义。在无氧或极少氧情况下 ， 能利用金属表面的有机物作为碳源 ,并利用细菌生物膜内产生的氢 ,将硫酸盐还原成硫化氢 ， 从氧化还原反应中获得生存的能量。 1 硫元素转化细菌 硫化细菌主要靠氧化硫化物获得能量，同化二氧化碳。其中的氧化亚铁硫杆菌，不仅能氧化元素硫和还原 态硫化物，还能在氧化亚铁为高铁的过程中获得能量。硫化细菌的典型代表是硫杆菌属（ Thiobacillus）的细菌，是革兰氏阴性细菌，无芽孢、极生鞭毛的小杆菌，大多为严格化能自养型，在有氧条件下硫化细菌是指能将还
4、原态硫化物 S、 H2S、 FeS2、 S2O32-、 S4O62-氧化为氧化态硫化合物 SO42-的细菌。硫化细菌广泛分布于土壤和水中，其氧化作用提供了植物可利用的硫酸态硫素营养。硫化细菌的类型多样，有的是丝状，如贝氏硫细菌（ beggiatoa），发硫菌（ thiothrix），有的是单细胞，如一些无色硫细菌（ achromatium）；有的靠鞭毛运动，如硫小杆菌（ thiobacterium）、硫化叶菌（ sulfolobus），有的无鞭毛靠滑动进行运动，如某些贝氏硫细菌；有的是严格化能自养型，有的是兼性自养型；有的菌虽能氧化硫化物成硫酸，但在体内不积累硫磺粒，如硫杆菌（ thiobac
5、illus）中的许多种属，习惯上称这类菌为硫化细菌。 硫酸盐还原细菌又称脱硫细菌，它可以广泛利用有机物的同时把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和连二亚硫酸盐还原成硫化氢、沉积硫。目前已分离研究的SRB 有 18 个属近 40 多个种 2。随着新的脱硫弧 菌属的发现， Saunders 等人按DNA中碱基组分含量的方式将 SRB分为三大类： 61 (G+C)、 52 (G+C)、 45 (C+C)。根据最新 Alexander L的 SRB分类，可以将硫酸盐还原菌分为细菌界和古细菌界两大类，而在这两类中又以细菌界占主导地位 3。细菌界包括 紫色光合细菌门、厚壁菌门、硝化螺菌门和热脱硫菌门。其中最主要
6、的菌种为 紫色光合细菌门，有 34 个属已被发现。硝化螺菌门只有嗜热脱硫弧菌属，热脱硫菌属门有两个属被发现。 Gitte Lind Mogensen等人在 2005年报道了一种从 活性污泥中发现的新的硫酸盐还原菌种 (DvO5T)，该菌种归于脱硫弧属 4。 2 研究方法 2.1 MPN 计数法 5-7 MPN 法又称稀释频度法， Griess 试剂用于检测 NO2-； MPN-二苯胺法用于检测 NO3-。 优缺点： MPN-Griess计数法操作简单、方便，工作量小，可进行大批量样品的检测，对仪器设备要求低，检测灵敏度最高；但需时间长，培养基不适合所有 N 元素转化细菌，分散工作也难以做好，导
7、致检测结果可能偏低，并且无法进行特定种属的硝化细菌的计数检测。 2.2 荧光原位杂交 (FISH)8 荧光原位杂交 (FISH)属于分子生物学中的核酸杂交技术，可快速检测硝化细菌的数量和分布情况。 FISH技术是利用硝化细菌特异性的探针，在原位检测水环境或生物膜上的硝化细菌时，不仅能对它们定性地检测，而且还能定量地反映出环境中硝化细菌的分布和丰度，为研究硝化系统中硝化细菌类群的空间和数量分布提供了有效的检测手段。 优缺点： FISH 能将单种细菌从复杂的菌群背景中检测出来，并加以定量，时间短，最快只需几小时，能鉴定到科、属、种；但所需设备昂贵，检测用具修饰成本高，对实验人员也有较高的专业要求，
8、探针 到达目标位置的机率以及样品自发荧光等多种问题目前也有待解决，这些也都限制了 FISH技术的推广使用。 2.3 偶氮盐 (INT)还原计数检测法 偶氮盐 (INT)还原计数检测法对活性污泥中的硝化细菌进行检测，所得的结果与传统的 MPN-Griess法检测值有着很好的相关性。 优缺点：操作简单，对仪器设备要求低，时间短，仅需 2天；但方法的可靠性需要进一步的验证，无法进行特定种属的硝化细菌的计数检测。 2.4 PCR8-9 聚合酶链反应（ PCR）是一种在体外快速扩增微量靶 DNA，结合最大可能数法，对硝化细 菌进行快速定量的方法。 优缺点：检测所需时间短；对不可培养的硝化细菌也可进行检测
9、；可进行不同类群的硝化细菌的检测计数；但无法区别死活菌；操作较复杂，需进行 DNA抽提等； DNA 抽提效率有待提高，检测灵敏度较其他方法差：需要昂贵的专业仪器 (PCR仪，凝胶成像系统等 )。 2.5 免疫检测技术 10 免疫检测技术是基于细菌的血清学，利用细菌细胞表面的聚合物具有较强的免疫原性，产生抗体，结合酶、荧光染料等物质标记的抗体建立起来的一类微生物检测技术。 优缺点：该技术是检测微生物的有力工具，既能定性分析也能定量检测；但可能出现由于抗体与其它微生物交叉反应或与微小颗粒非特异结合而导致的假阳性，以及胞外聚合体的存在使得抗体难以和目标微生物结合产生的假阴性，免疫技术的应用也因硝化细
10、菌的血清学多样性而受到限制。 2.6 变性梯度凝胶电泳 (DGGE)11 变性梯度凝胶电泳 (DGGE)主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异 ， 利用变性梯度胶进行分离。 优缺点：检测片段精准度高，加样量小，重复性好 ， 操作简便 ， 快速；但一般不能确定突变位置 ， 最终还得依赖于 DNA测序 。 Voytek MA 等应用特异引物的 PCR扩增方 法并用特异性探针杂交表明，北极采来的菌为亚硝化细菌，说明了该亚纲硝化细菌的广泛分布； Hiorns等采用特异性引物的 PCR 扩增的方法，表明亚硝化螺菌属的特异性及其在环境中的广泛存在； McCaig等应用多种方法，包括
11、MPN、 PCR、 DGGE和序列分析，研究了污染海洋渔场沉积物中氨氧化细菌的群落结构，表明氨含量和污染程度越高其氨氧化细菌含量也越高， DGGE 和 16SrDNA 分析表明主要是亚硝化单胞菌（ Nitrosomonas）类群的增加； Hastings等应用 MPN、 PCR、核酸探针杂交等分子生物学技术对富营养化的 淡水湖的氨氧化作用进行了季节变化的研究，表明夏天具有较强的硝化作用，水中的氨氧化细菌随季节有较大的变化，主要是一些耐氨浓度较高的亚硝化螺菌（ Nitrosospira）增加了，而底泥的氨氧化细菌随季节的变化不大； Bartsoch等发展了多种单克隆抗体，他们可以分别对应硝化菌的
12、不同属，因此可以对分离菌株的快速鉴定，也可以用于环境样品中这些属的硝化细菌的快速检测；利用不同的寡核苷酸探针通过 FISH技术研究的结果也可说明在所有的水处理污泥和生物膜样品中都存在大量的硝化螺菌（ Nitrospira），而硝化杆菌（ Nitrobacter）只在 SBR的生物膜中找到 12。 3 硫元素转化细菌的研究分布 湿地土壤具有硫酸盐浓度高、土壤粘度大、氧含量少等特点，造成参与硫循环过程的 2 类主要微生物类群硫化细菌和硫酸盐还原在土壤中的分布存在显著差异，硫化细菌则因需氧或光而分布于土壤表层（ 02cm），而厌氧的 SRB 主要分布于土壤深层。 硫酸盐还原菌（ SRB）是湿地土壤中
13、数量最大的类群之一，它在该生态系统的硫循环过程中扮演着重要角色。 SRB 是一类分布很广的土壤细菌，除在硫酸盐含量较高的湿地土壤中为优势种群外，如脱硫菌属、脱硫杆菌属、 脱硫八叠菌属和脱硫线菌属等，也分布于淡水湿地土壤和稻田中，如脱硫弧菌属和脱硫叶菌属细菌，表现出高度的生物多样性 13。目前发现的硫氧化微生物种类较多，主要有 3 类： (1)无机化能自养细菌（如硫杆菌属） ； (2)厌氧光合自养细菌（如绿硫细菌、紫硫细菌） ； (3)极端嗜酸嗜热的古生菌类（如硫化叶菌） 7。有关硫循环过程中微生物的作用详见闵航（ 2005） 14的阐述。 19 世纪初随着现代农业科学的开创，土壤微生物的研究也
14、开始进入科学家的视野。近年来，随着环境保护和可持续发展意识的不断提高，各地也都纷纷展开了对滩涂 湿地中硫元素转化细菌的研究。 刘慧慧等（ 2002） 8通过对杭州湾南岸慈溪滩涂贝类养殖区的研究表明：在滩涂养殖环境中 ， 硫酸还原细菌的检出率是 100%， 而且其数量维持在较高的水平，全年波动在 9.00103个 g-1 4.00106个 g-1之间，并推测滩涂沉积物环境在不断恶化；在垂直分布上 ， 滩涂表层和底层中硫酸还原细菌的数量相差不大 ，处于同一个数量级 ， 但由于环境温度、有机物含量、氧化还原电位等因素的影响 ，滩涂表层硫酸还原菌的数量波动幅度较大 ， 而底层滩涂环境则相对稳定 ， 硫
15、酸还原菌数量的波动幅度也较小。 王美珍等（ 2002） 15通过对杭州湾南岸滩涂的微生物数量分布研究表明：在滩涂养殖环境中，硫酸还原细菌的检出率是 100%其数量维持在较高的水平，全年变化范围为 9.00103cfug-1 9.00106cfug-1 平均值为 8.42105cfug-1， 说明经过常年不间歇的养殖以后，滩涂养殖环境已经开始恶化。 薛超波等（ 2003） 16通过对宁波市北仑区贝类养殖滩涂的研究显示：硫酸还原菌的数量全年波动在 5.00104个 g-1 5.00106个 g-1之间。在空间分布上，滩涂表层硫酸盐还原 细菌的数量均高于底层；在时间分布上 , 硫酸盐还原细菌的数量
16、11 月份最高 ， 7 月份最低。经过常年不间歇的养殖以后 ， 滩涂贝类养殖环境已开始恶化 ， 有机物含量大量增加 ,造成细菌的大量繁殖 ,病原菌大量滋生 ， 是造成宁波市滩涂养殖贝类大规模死亡的主要原因。 许艳丽等（ 2006）通过对三江平原沼泽湿地中硫酸盐还原细菌的研究表明：土壤硫酸盐还原菌数量级为 103个 /g，数量随土壤 pH和 Eh的上升而增加；同时对 3种土壤的分析表明沼泽湿地开垦，可以明显地刺激土壤土著硫酸盐还原细菌生长，影响其分布，对开垦后的湿地进行退耕修复，土壤硫酸 盐还原菌数量可以朝其原始生态分布水平发展，但将会是一个长期的过程。 刘芳等（ 2007） 17对黄河三角洲湿
17、地的研究测得当地土壤中硫酸盐还原菌种属有 Desulfurom- onos sp.、 Desulfobulus sp.、 Desulfoacterium sp.、 Desulfovibrio sp.、 Desulfobacter.等。 4 展望 目前，对于 N 元素转化细菌以及硫元素转化细菌的研究越来越多，研究方法也层出不穷，但却仍然缺乏一种既价格便宜又能深度检测的方法。为了更深度的了解环境状况，寻求一种更好的研 究方法将是一个重要的课题。 随着我们对 N 元素转化细菌以及硫元素转化细菌的越加了解，必然的，我们对其的利用也将更上一个台阶。而如何去综合考虑其性质配合地理环境与季节、水流等环境因素
18、相结合的办法，以求达到最佳的治理目的，也将是一个长久的话题。 参考文献 1 王雪峰 ,林建群 ,韩梅等 .细菌铜抗性机制研究进展 J.湖北农业科学 ,2009,48(1):218-223. 2 彭字光 ,诸林 ,张金钟 ,秦锋 .耐氧硫酸盐还原茵的研究进展 J.河南化工 ,2011.28(2):115-131. 3 俞毓馨 ,吴国庆 ,孟宪庭等 , 环境工 程微生物检验手册 J.中国环境科学出版社 ,北京 . 199 0(12):250-261 4 陈绍铭 ,郑福寿 . 水生微生物学实验法 M. 海洋出版社 .北京 .1985,9.189-194. 5 明镇寰 ,岳春梅 .生物硝化池污水中硝化
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