1、本科毕业论文 文献综述 环境科学 假单胞菌的检测方法研究进展 摘要： 假单胞菌是医院感染的主要病原菌，也是重要的食源性和水源性致病菌，对人类的健康产生了威胁。建立一种快速、准确的检测方法迫在眉睫，对动物和人类有着重大作用。本文对近年来假单胞菌的检测方法的进展进行了概述：从传统的生化检测方法到免疫学检测方法，最后逐渐转变为使用分子生物学检测方法， 其特异性越来越强、灵敏度越来越高、操作越来越简单、检测时间也越来越短。 关键词： 假单胞菌；检测方法；进展 1 前言 假单胞菌广泛存在于土壤、淡水、海水以及生物体中，为革兰 氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜，单鞭毛或多鞭毛，专性需氧，能产生水溶生长性色素或者
2、荧光，可从蔬菜、水果、植物、土壤自来水、蓄水池等水体中分离得到。阳光富等 1根据 16S rRNA序列将假单胞菌被分为两大类：第一类六个组包括丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae)、绿针假单胞菌（ Pseudomonas chlororaphis）、恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌菌 (Pseudomonas aeruginosa)和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri )；第二类只有一个组，代表种为穿孔假单胞菌 (Pseudomonas pertucino
3、gena)。假单胞菌多为条件致病菌，是医院感染的主要病原菌，铜绿假单胞菌为其代表菌种，它对清洁水源的污染也已经引起了很多专家的特别关注。由于长期以来的抗生素和杀菌剂等的大量使用，假单胞菌对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病，严重威胁了人类的健康。因此，假单胞菌的检测方法的研究，准确、快速的确认 和检测假单胞菌，对控制动物和人类的假单胞菌感染和开发高效的杀菌剂等有着极其重要的意义。 2 假单胞菌的检测方法 为了寻求快速、简便、有效、准确的检测方法，国内外学着进行了大量的研究，从以传统的培养方法为基础发展到以免疫学、分子生物学为基础的快
4、速检测方法，实现了假单胞菌的快速、准确的检测，并在实践中不断取得新的进展。 2.1 传统 的检测方法 国标中对铜绿假单胞菌的检测采用的是传统的培养方法，该方法主要依靠假单胞菌的生物学特征 ， 通过样品前处理、增菌、分离培养，再对其生理生化特征进行分析鉴定，根据不同的样品采取不 同的处理方式。传统国标法操作比较繁琐复杂、耗时又费力 ， 至少需要 3天才能得到明确的结果，而且检测的灵敏度低， 易受到各种因素的影响，假阴性率较高 2。 2.2 免疫学方法 免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应 ， 观察和研究组织细胞、特定抗原 （ 抗体 ） 的技术。为了显示和观察这种抗原抗体反应 ， 需要预先将某种标记
5、物结合到抗体上 ， 借助标记物的荧光或酶的有色反应、放射性或高电子密度 ， 在光镜或电镜下进行定性、定位或定量的研究。 2.2.1 酶联免疫吸附方法（ ELISA） 酶联免疫吸附法采用抗原与抗体的反应将待测物与酶连接，然后 通过酶与底物产生显色反应，用于定量测定。该方法有三种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）、酶标记的抗原或抗体（标记物）、酶作用的底物（显色剂）。由于该方法具有高度特异性和灵敏性，结果准确、重现性好，廉价、方法操作简单，样品处理量大等优点，是目前最常用的免疫检测方法之一。刘秀梅 3等以 椰毒假单胞菌种特异因子 0-I McAb 对椰毒假单胞菌的抗体抗原进行了分析，准确的
6、验证了 0-I McAb 的种特异性，其阳性检出率为 100%。王燕等 4利用原核表达系统构建并表达 OprF蛋白后 ， 采用杂交瘤技术制备抗 OprF的特异性单克隆抗体(mAb)， 并成功建立了一种检测铜绿假单胞菌抗原的双 mAb 夹心 ELISA 方法来检测铜绿假单胞菌，不与其他细菌发生交叉反应，可同时检测大量样本 ， 有利于临床使用。 2.2.2 KinExA 检测 KinExA(Kinetic Exclusion Assay: 平衡弃除免疫测量法 )是一种计算机控制的流式荧光计，用来进行自由抗体、自由抗原和抗体 -抗原复合物的快速分离和定量检测 。 KinExA 由毛细管流 /观察单元
7、组成并配有多微孔筛，各种被测液能在负压下通过筛孔。统一大小的小珠堆积在筛子上形成了一 个填充床，其表面包被固化抗原 5。 苏凤宜 6用 KinExA 检测铜绿假单胞菌，检测的灵敏度和定量范围接近或优于其他免疫检测方法。作者将 KinExA 与 ELISA 进行了比较，结果显示 KinExA 的结果比 ELISA 的结果灵敏 10100 倍，这充分体现了 KinExA 检测细菌比常规手段具有明显更高的灵敏度。而且 KinExA 的检测数据重复性强、偏差小，具有很高的精确度。因此有望成为一种可靠的、具有潜在应用前景的细菌免疫检测方法。但是 KinExA 方法才刚起步，仍然存在很多限制因素，有待在不
8、断的研究中得到改进和完 善。 2.2.3 压电免疫传感器芯片技术 压电免疫传感器芯片技术，是将免疫反应与石英质量微天平 （ QCM） 相结合的一种新型免疫传感器应用于病原微生物的检测 7。陈斌 7将石英晶体绿脓杆菌微阵列免疫传感器用于绿脓杆菌的分型检测，观察结果显示，除该型特异性分型血清芯片和绿脓杆菌单克隆抗体包被的芯片发生明显的频率响应外，其它各型芯片的频率响应均与传感器的参比芯片噪声信号无显著性差异。其灵敏度为 91.9%，特异性为 100%，假阳性率为 0%，假阴性率为 8.1%，表明可用于绿脓杆菌的临床检测。但是由于各种因素的限制， 还需进一步优化实验条件。 2.3 分子生物学检测 分
9、子生物学检测技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，它是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。分子生物学的发展使微生物的检测从生化、免疫方法转向基因水平的检测，这些检测方法具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点。用于假单胞菌的检测主要有 PCR检测、荧光实时 PCR检测、 LAMP检测和全自动菌种检定系统检测等。 2.3.1 聚合酶链反应（ PCR）检测 PCR 技术是一项体外酶促扩增 DNA技术 , 具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点，为最常用的分子生物学技术之一。 2005年，代艳杰等 8用类鼻疽假单胞菌鞭毛蛋
10、白的基因作引物 ， 用 PCR扩增的方法检测 6种土壤中不同浓度的类鼻疽假单胞菌和 3个假单胞菌属的 3种对照菌，结果显示该法具有高灵敏度，对照菌为阴性。 2004年， Scarpellini 等9针对 16 S rRNA 基因设计了引物 16SPSEfluF/R，目前常被应用于检测和鉴定荧光假单胞菌。 2010年，邓显文等 10依据 16 23S rRNA基因间隔区序列建立 PCR检测体系，诊断罗非鱼的荧光假单胞菌病，但仅对 4株荧光假单胞菌分离株进行了验证。杨一林 9等分别针对 1623S rRNA基因间隔区序列、 gyrB基因以及通过生物信息学方法发掘到的 4个种特异性基因，设计了 6对
11、检测引物，通过初步特异性实验，筛选出一对种特异性最佳的引物，最终建立了以 gyrB基因为检测靶点的 PCR扩增体系。该方法可特异检测荧光假单胞菌的存在，纯 DNA的 检测灵敏度为 14.9fg/L (2 3 拷贝 /L)，纯培养物的检测灵敏度为 2.8102cfu/mL。 2007年， R. Lavenir等 11发展了以特异性 ecfX为靶基因检测铜绿假单胞菌的方法，结果得到了预期大小的目的条带，而没有其他多余的扩增带，表明了其高度的特异性。 张淑红等 12根据外膜蛋白基因 oprL进行 PCR扩增，扩增出 504bp大小的目的条带，与铜绿假单胞菌对照菌株的条带一致，说明检测结果呈阳性。其检
12、出率高于相同条件下的传统方法，且与铜绿假单胞菌的相似率大于 99%。 2.3.2 实时荧光定量 PCR 方法 荧光实时定量 PCR技术是一种快速、敏感、简便、准确的定量检测技术 ，而 且自动化程度高，大大降低了污染的可能性 ， 能够同时完成多种样品的扩增及定量， 已成功 应用于各类致病菌的检测 。 2006年，薛利军等 13将 16S rDNA作为荧光定量 PCR的靶基因检测铜绿假单胞菌，结果显示设计引物的靶向序列，仅对假单胞菌的 16S rDNA有高度同源性，该方法灵敏度达 3.6pg/L，并且具有很强的特异性。 2007年， 杨曼琼 14以铜绿假单胞菌的 oprI基因为目的基因进行 PCR
13、扩增， 与传统培养相比其特异性吻合率达 100%， 灵敏度可达到 10-1/l。因此该方法可以准确快速的检测铜绿假单胞菌，可望用于临床铜绿假单胞菌感染的快速诊断。2008年，肖性龙等 15将 ETA基因 作为荧光定量 PCR靶基因设计 TaqMan探针，建立荧光实时定量 PCR法快速检测铜绿假单胞菌，相比传统的检测方法有更高的灵敏度和更好的特异性。吴炳坤 16等根据铜绿假单胞菌 gyrB基因序列设计引物，采用一步法逆转录实时荧光定量 PCR反应检测铜绿假单胞菌以及甄别死活状态，仅有铜绿假单胞菌为阳性扩增，其余均为阴性，说明具有较高的特异性，且其最低检测线达 102cfu/mL。 2.3.3 R
14、iboprinter 系统的检测 Riboprinter 是一种以 DNA指纹为基础的全自动菌种鉴定系统，它通过 16S-23S-5S rDNA探针与待测菌株酶切后染色体 DNA的杂交图谱，与数据库进行比对，然后进行菌种鉴定，排除人工操作差异的干扰。姜艳彬等 2通过 Riboprinter 全自动菌种鉴定系统分别对两株样品进行了鉴定，并采用 16S rDNA序列测定结合生理生化实验进行了对照，两种检测方法得了出相同结论， Riboprinter还可能 进一步检测细菌。但是这种方法只适用于细菌的分类鉴定，且数据库还有待完善。 2.3.4 环介导等温扩增 LAMP 反应检测 环介导恒温扩增技术 (
15、 loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种利用能特异性结合于靶 DNA上的 6个特定区域的 4条引物和一种具有链置换活性的 DNA聚合酶 ， 在恒温条件下高效扩增核酸 ， 1 h 即可完成 ； 反应产物经琼脂糖凝胶电泳呈阶梯状。该技术具有高特异性、快速、灵敏、高效，操作简便，不需要特殊仪器，仅简单的恒温水浴锅就能完成等特点。现已广泛应用于病毒及微生物的快速检测 17。目前环介导恒温扩增结果判定的主要方法有直接电泳、直接观察扩增管的浊度和加入染料用肉眼判定结果这三种方法。 2010年，张淑红 18等以铜绿假单胞菌 ecfX为特异 性靶基因进
16、行 LAMP检测，结果只有铜绿假单胞菌为阳性，其他均为阴性，其最低检测限为 1.57101cfu/mL 1.57102cfu/mL。张淑红 12等对传统检测方法、 PCR方法和 LAMP方法进行了比较，显示了 LAMP方法操作更简单，不需昂贵仪器，仅水浴锅就可以完成；结果可用肉眼直接观察；而且其灵敏度和特异性也优于常规 PCR法。 2.4 其他方法 2.4.1 API 系列试剂条 近年来 ， 陈冠武 等 19用法国生物梅里埃推出的 API 系列试剂条检测铜绿假单胞菌。通过与传统检测方法比较发现， API 系列试剂条可 得出具体的种属名称及鉴定分析，而传统的检测方法只能得出是或否的结论， API
17、 系列试剂条已在各检测机构得到广泛应用。陈求欢等20采用 API20NE 生化鉴定试剂条对饮用天然矿泉水中的铜绿假单胞菌进行鉴定，并与国标GB/T8538-2008 方法比较，结果证明 API20NE 生化鉴定试剂条更加快速、方便、准确可靠。但是 API 试剂条的使用基于平板培养，所以具有较大的人为和系统误差，因而这种方法也有待改进。 2.4.2 应用气味指纹技术检测猪肉假单胞菌 胡惠平等 21利用顶空 - 固相微萃取 - 气相色谱 - 质谱联用技术 (HSSPME-GC-MS)结合电子鼻技术分析从猪肉中分离的假单胞菌纯培养后的挥发性代谢产物气味指纹，快速的将假单胞菌进行区分和鉴别，表明该技术
18、可以应用于假单胞菌等食品中微生物的快速无损检测。 3 小结和展望 传统方法历史悠久，由于形态学和理化特性的检测可以提供菌种特性的直观数据，将会继续与分子生物学技术共同应用于微生物检测领域。但是，相比较而言，分子生物学技术不但不需要预培养，而且具有更高的准确度、灵敏度和特异性，因而被越来越广泛的应用于微生物学的检测。其中， PCR 是现代生物技术的核心技术，也是最为广泛应 用的方法之一，但该方法对实验设备的要求相对较高，而且具有一定的假阳性率，不适用于基层实验室的检测工作。同样作为一种基于核酸扩增的检测技术，环介导等温扩增（ LAMP）技术因为其高灵敏度、高特异性、快速、经济的优点，近年来获得飞
19、速发展，在包括病毒、细菌、原生动物性寄生虫等各种各样病原检测中发挥了良好的效果。随着 LAMP 技术的改良和发展，目前不开盖的 LAMP 检测技术获得了很多重视和应用，克服了早期 LAMP 易引起交叉污染的最大不足，可以预期， LAMP 有可能与 PCR 一样，将会在各个微生物学领域获得长足应用和发展。参 考文献 1 杨光富 ,魏云林 .假单胞菌研究现状及应用前景 J.生物技术通报 ,2011,(1):37-39. 2 姜艳彬 ,王海 ,侯东军等 .两种快速细菌菌种鉴定方法的比较 J.中国测试 ,2010,36(5):41-44. 3 刘秀梅 ,文卫华 ,杨宝兰等 .用单克隆抗体验证椰毒假单胞
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