1、毕业论文开题报告 环境科学 大黄鱼病原菌恶臭假单胞菌环介导等温扩增检测技术的建立 课题研究意义及国内外研究现状 大黄鱼（ Pseudosciaena crocea）隶属鲈形目、石首鱼科、黄鱼属，大黄鱼也叫大先、金龙、黄瓜鱼、红瓜、黄金龙、桂花黄鱼、大王鱼、大黄鲞等，是我国近海最重要的传统经济鱼类之一。大黄鱼主要分布于东海、黄海南部以及南海的雷州半岛东侧，水深 80m 以下的沿岸近海水域。近年来，网箱养殖大黄鱼已经成为沿海城市的主要渔业经济支柱之一。随着大黄鱼网箱养殖规模和养殖面积的不断扩大，病害的发生也日益频繁 ，频率和规模都呈逐年上升趋势；各种新的致病菌也不断的被发现，给大黄鱼养殖业的健康持
2、续发展带来了严重影响。目前已有许多学者对引起大黄鱼腐败假单胞菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌等细菌性疾病先后进行了报道。自 2008 年以来，不同的研究者屡次在我国东海海域患内脏白点 /结节病的养殖大黄鱼中分离到了恶臭假单胞菌，该病死亡率高，一旦发病，自然死亡率可达 70%80%；该病菌已在局部地域内呈流行态势，有必要引起十分的重视。 目前对“内脏白点病”并没有有效的防治方法，因此通过快速、特异的病原检测技术进行病原的早期快速 诊断无疑是对该病有效防控的重要措施。目前用于恶臭假单胞菌检测的方法包括生理生化鉴定和聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction， PCR）
3、。生理生化鉴定过程复杂，需要时间周期较长； PCR 法虽然灵敏度高，但假阳性率较高，且需要价格相对昂贵的 PCR 仪，对操作人员素质要求较高，对于基层实验室快速、经济地开展病原菌检测仍有许多不便之处。因此，作为一种基于核酸扩增的检测技术，环介导等温扩增（ LAMP）技术因为其高灵敏度、高特异性、快速、经济的优点，近年来获得飞速发展，在包括病毒、细菌、原生动物性 寄生虫等各种各样病原检测中发挥了良好的效果。本研究致力于建立这种技术，对恶臭假单胞菌进行快速诊断，为更好的生产防治提供技术依据。 课题研究的主要内容、预期目标和研究方案 课题研究的主要内容 从发病的大黄鱼中分离到 3 株菌 ；细菌 DN
4、A 的提取；用 PCR 法检测 rpoN靶基因； LAMP 反应条件及体系的优化，选出最佳温度、时间和反应体系的最佳量；细菌纯培养物检测 LAMP 方法灵敏度，与 PCR 方法作比较；特异性检测：用优化后的 LAMP 体系分别对恶臭假单胞菌、绿脓假单胞菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌等进行检测， 验证方法的特异性；大黄鱼病鱼组织和健康组织的检测，比较其结果的不同。 预期目标和研究方案 （ 1）可疑致病菌的分离： 以选择性培养基从不同批次的患病大黄鱼的病灶组织无菌分离可疑菌株。 （ 2） PCR 法检测 rpoN 靶基因 提取分离的细菌 DNA，根据恶臭假单胞菌 rpoN 基因的保守序列设计一套特
5、异性引物进行扩增。 （ 3） LAMP 反应及条件优化： 根据反应体系优化策略对内外引物比，镁离子浓度， dNTP 浓度，甜菜碱浓度等进行探索优化；对反应温度和反应时间进行探索优化。 （ 4）灵敏度检测： 检测细菌纯培养物的灵敏度，与 PCR 进行比较。 （ 5）特异性检测 用优化后的 LAMP 体系分别对恶臭假单胞菌、绿脓假单胞菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌等 10 种 17 株实验菌株进行扩增，用电泳和显色剂 SYBR Green I同时观察扩增结果，并进行 PCR 扩增与其进行比较，验证其方法的特异性。 （ 6）组织检测 对大黄鱼病鱼组织、治疗初期的病鱼组织和健康组织进行 LAMP 检测
6、，比较其结果的不同，以验证 LAMP 方法的灵敏度。 课题进度计划 2011 年 6 月 7 月 查找相关资料 2011 年 7 月 12 月 致病菌的分离鉴定；环介导等温 扩增检测技术的建立 2012 年 1 月 4 月 完成论文 2012 年 4 月 26 日 论文答辩 参考文献 1 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNAJ.Nucleic Acids Research,2000,28(12): 63. 2 毛芝娟 ,刘国勇 ,陈昌福 .大黄鱼溃疡病致病菌的
7、初步分离与鉴定 J.安徽农业大学学报 , 2002, 29 ( 2) : 178 181. 3 刘家富 ,余祚溅 ,林永添等 .大黄鱼假单胞菌病的初步研究 J.实验与技术 ,2004,28(2):5-8. 4 周瑞娟 . 网箱养殖大黄鱼主要疾病的预报模型研究 D. 宁波 :宁波大学 ,2011:1-5. 5 王丽 ,石磊 ,李琳 .DNA 环介导的恒温扩增法在快速鉴定病原微生物中的应用J.2006,26(5):462-464. 6 唐毕锋 ,综述 ,马立业等 .环介导等温扩增技术的应用和发展 J.实用医学杂志 ,2008,24(22):3972-3974. 7 Xue en Fang, Jian LI, Qin Chen. One New Method of Nucleic Acid Amplification Loop-mediated Isothermal Amplification of DNAJ.VIROLOGICA SINICA,2008,23(3):167-172.
