1、本科毕业论文（20 届）林蛙皮中提取胶原蛋白的方法比较所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 长春工业大学毕业论文I摘 要中国林蛙，属于两栖类珍稀动物。中国林蛙以其独特的营养价值与药用价值日益受到人们的重视，是蛙类中最有经济价值的一种。林蛙富含多种氨基酸、激素、微量元素和维生素等营养成分，在药用、滋补和美容等方面都具有非常高的利用价值。林蛙皮是摘取林蛙油后作为饲料或废弃物的物质。本研究立足于中国林蛙资源丰富以及蛙皮中含有大量生物活性物质这一优势，以干燥的林蛙皮为原料，用不同方法对林蛙皮进行胶原蛋白提取试验，利用羟脯氨酸比色法比较了几种方法的提取效果
2、，得出最佳的提法方法，并通过单因素试验及正交试验对最佳提取方法进行优化。结果表明：酸法浸提是从林蛙皮中提取胶原蛋白的最佳方法，液料比为20:1，利用0.1mol/L柠檬酸在37下浸提48h为最佳工艺条件。关键词：林蛙皮；胶原蛋白；方法比较；最佳工艺长春工业大学毕业论文IIAbstractRana chensinensis, belongs to the amphibian of rare animals. The rana chensinensis has been paid increasingly attention by people with its unique nutrition
3、value and medicinal value, and becomes one of the frogs which have most economic value. Rana is rich in amino acids, hormones, trace elements, vitamins and other nutritions, and has very high value in the use of pharmaceutical, tonic, cosmetic and other aspects. Rana skin is gathering after rana oil
4、 as feed or waste material. This study bases on the advantage that rana chensinensis resources are rich and rana skin contains a lot of biological active substance, with dry rana skin as raw materials, using different methods to the extraction test by rana skin collagen, then compared several method
5、s of extraction effect by hydroxyproline colorimetric method to get the best extraction method，and through the single factor experiment and orthogonal experiment, the best extraction method is optimized. The results show that: acid extraction is the best method of collagen protein extracted from the
6、 frog skin, liquid to solid ratio 20:1，using 0.1 mol/L citric acid in 37 soaks raises 48h is the best technological conditions. Key words: Rana skin; collagen protein; comparison of methods; best technological conditions 长春工业大学毕业论文III目 录摘 要 .IAbstract.II目 录 .III第一章 前 言 .1第二章 文献综述 .22.1 林 蛙 皮 .32.1.1
7、 林蛙皮的功能 .32.1.2 林蛙皮中胶原蛋白 .52.1.3 林蛙皮研究现状和应用前景 .62.2 胶原蛋白 .72.2.1 胶原蛋白的结构 .72.2.2 胶原蛋白的功效 .82.2.3 胶原蛋白的应用 .112.2.4 胶原蛋白的发展趋势 .132.3 胶原蛋白的提取方法 .142.3.1 酸法 .142.3.2 碱法 .142.3.3 酶法 .142.3.4 盐法 .142.3.5 热水法 .152.4 本论文的研究内容及研究意义 .15第三章 实验部分 .163.1 材料与设备 .163.1.1 原材料 .163.1.2 主要仪器 .163.1.3 主要试剂 .163.2 林蛙皮中
8、提取胶原蛋白试验方法 .173.2.1 胶原蛋白的提取工艺方法 .173.2.2 对二甲氨基苯甲醛法测定林蛙皮中胶原蛋白的含量 .173.3 结论与讨论 .19长春工业大学毕业论文IV3.3.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制 .193.3.2 胶原蛋白提取的试验结果比较与讨论 .203.4 最佳提取方法的工艺优化 .213.4.1 酸法提取溶剂的选择 .213.4.2 单因素试验 .223.4.3 正交试验 .25第四章 结论与展望 .274.1 结论 .274.2 展望 .27致 谢 .28参考文献 .29长春工业大学毕业论文1第一章 前 言中国林蛙（Rana chensinensis），是我国山
9、区，尤其是东北山区，包括长 白山 脉 、小兴安岭大部、张 广 才 岭 腹地，纯野生动物，亦被称作哈什蚂（哈士蟆）。其与蛤蟆、田 鸡 完全是非同原动物。唯中国仅有，已被列为易危物种。是集药用、食补和美容功能于一体的珍稀两栖类动物 1。中国林蛙凭借其特有的营养价值与药用价值日益受到人们的重视，成为蛙类中最有经济价值的一种。在各地所产的林蛙中，以东 北 地 区 的林蛙体格大、产油率高、体制健壮、繁殖率高而成为林蛙中的极品。中国林蛙富含 18 种氨基酸、4 种激素、13 种微量元素和 9 种维生素 2，在药用、滋补和美容方面都具有非常高的利用价值。林蛙的营养价值比较高，俗称“大补品” 。由于其主要以昆
10、虫类为食，因此又称“ 农林卫士 ”和“纯绿色食品” ，在近些年市场上显现出了巨大的商机。中国林蛙皮中含有丰富的胶原蛋白资源。胶原蛋白富含除半胱氨酸和色氨酸外的 18 种氨基酸，其中有 7 种是维持人体生长所必需的氨基酸，在胶原蛋白中甘氨酸占 30，而脯氨酸和羟脯氨酸含量共占约 25，是各类蛋白质中含量最高的，此外，丙氨酸和谷氨酸的含量也都比较高 2，同时胶原蛋白还含括了一般蛋白质中极少见的羟脯氨酸和焦谷氨酸以及在其他种类蛋白质中几乎不存在的羟基赖氨酸。有资料报道：胶原蛋白肽可以被人体主动且无障碍吸收 3。由此可见，胶原蛋白具有十分丰富的营养。本课题立足于中国林蛙资源丰富以及蛙皮中含有大量生物活
11、性物质这一优势 4，以干燥的林蛙皮为原料，对从林蛙皮中提取胶原蛋白相关提取方法比较做重点研究。目前广泛采用的提取胶原的方法主要分为酸法、碱法、酶法、盐法以及热水浸提法5类。本课题以干燥的林蛙皮为原料,研究其胶原蛋白的酸法、碱法、酶法、盐法及热水法提取工艺条件,对比不同提取方法提取得到的胶原得率，比较出最佳的胶原提取方法，并通过单因素试验及正交试验对最佳的提取方法进行优化，从而得出最佳的工艺条件。长春工业大学毕业论文2第二章 文献综述中国林蛙（Rana chensinensis），俗称哈什蟆，在分类上属于两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属 2，主要分布在中国东北山区，包括长白山脉、小兴安岭大部等地，是纯
12、野生动物，为国家二级保护动物 1。中国林蛙与蛤蟆、田 鸡 完全是非同原动物。近年来由于过量捕获，林蛙已被列入中国濒危动物红皮书，为易危（v）物种 1。中国林蛙是集药用、食补和美容功能于一体的珍稀两栖类动物。中国林蛙凭借其特有的营养价值与药用价值日益受到人们的重视，成为蛙类中最有经济价值的一种。在各地所产的林蛙中，以东 北 地 区 的林蛙体格大、产油率高、体制健壮、繁殖率高而成为林蛙中的极品。中国林蛙富含 18 种氨基酸、4 种激素、13 种微量元素和 9 种维生素，在药用、滋补和美容方面都具有非常高的利用价值 2。林蛙的营养价值比较高，俗称“ 大补品” 。林蛙全身是宝：这其中林蛙皮是高级制革业
13、的主要原材料；林蛙卵中富含卵磷脂和性激素；林蛙肉凭借其低脂肪、高蛋白的特性可加工成高级保健品 5；林蛙雌蛙输卵管的干燥物即林蛙油，又称哈什蟆油，是极其珍贵的药材 6。哈什蟆油是我国医学中记载使用的滋补强壮之药物，有补虚、增精、解毒、退热、消肿、润肺、益肝肾、健脾胃之功效，可治疗神经衰弱、失眠眩晕、脾胃虚弱、体弱气虚、咳嗽肺虚、创痛肿毒、水肿腹胀、肝炎和疮疾、肺结核等疾病 2。此外，提取到林蛙油后的副产品，如骨骼、内脏、肌肉等也可作为毛皮动物的饲料，又可浸泡后入药。林蛙除了药用、美容、保健、饲料价值外，在中国东三省和广东、台湾及东南亚等地又被人们充分的认可，具有纯天然的绿色的药用和食用价值，因而
14、，具有广泛的消费市场。 中国林蛙中雌蛙体长约为75mm左右，雄蛙体长较小；林蛙的头部很发达，位于身体的前端，背面观呈三角形，扁而宽，头长路小于头宽，头长与体长相比较，为体长0.32-0.38倍；林蛙的口宽阔，位于吻端腹面，吻尖，向前突妯，略长于下颌，吻端上方有一对外鼻孔，其上有瓣膜，可随时开闭，以长春工业大学毕业论文3控制气体进出，头两侧有大而凸出的眼，眼有上下眼睑，下眼脸的上方有二层折叠的眼睑，可以上下移动遮着眼球以适应陆地生活，两眼后方各有一圆形鼓膜、遮着鼓室并传导空气中声波产生所觉；雄蛙在鼓膜后的两侧各有一个声囊；林蛙的躯干部自颈椎部起至体后端正中部分，即鼓膜之后为躯干部，是身体各部分中
15、最大的一段，短而宽，躯体腹部较膨大，雌性比雄性大，没有明显的颈部，末端有二个泄殖腔孔，为泄殖腔的开口；林蛙的前肢由上臂、前臂、腕、掌、四指组成，短而细，上臂部与手部长度相比，上臂略短于手长，指瑞无爪并钝圆，关节下瘤、趾基下瘤及内外掌突均明显，指间无蹼，指长顺序为3、1、4、2；前肢背面有3-4条环形黑斑，雄蛙第一手指内侧有一瘤状物为软婚垫；林蛙的后肢发达，由股、胫、跗、五趾组成，其长度为前肢的2.5-2.7倍，胫长超过体长之半，后肢拉直前伸，即胫跗关节前伸可超过眼部，伏卧时两后肢的脚跟部常相互重叠，膝部内侧有一明显的突起；趾细而长，具五趾，第1脚趾很短，第4趾特长，为第1趾长的4倍，趾长顺序为
16、4、5、3、2、1，趾间有蹼，很发达，呈薄膜状，蹼殊缘有浅凹，除第4耻外均达趾端，蹼膜宽顺序为5-4、4-3 、3-2 、 2-1，后肢肌肉发达；因此，林蛙善于跳跃、游缺、攀登、爬行。2.1 林 蛙 皮2.1.1 林蛙皮的功能中国林蛙皮在生命停止后，无论在水中泡或是烈日下晒，还是在阴干的地方存放，它的形体几十年不会变质、不会霉烂。冬季东北林蛙在河水冻成冰时，由于胸腹呼吸困难，因此可用皮肤进行呼吸，夏季在进入森林中，用皮肤从土地中、露水中吸水，其性格被堪称动物中典范。(1) 林蛙皮的保湿功能林蛙可以用皮肤呼吸并吸收水分，其机体具有完善的保湿系统，林蛙的某些组织中天然保湿因子含量较高，尤其是保湿因
17、子的典型代表物透明质酸(Hyalu ronic acid，HA)的含量与牛眼玻璃体中 HA 的含量接近，而牛眼玻璃体中 HA 的含量是至今为止动物性原料中 HA 含量最高的。HA 是目前世界公认的性能优越的保湿因子，其分子中的羧基和其他极性基团可与水形成氢键而结合大量的水，当含量低于0.1时，HA 可结合其质量1000倍的水。这种天然保湿因子可使皮肤含水量增加，表皮角质层柔软，改善皮肤表面的血液循环，增强皮肤弹性，阻止表皮细胞纤维化，从而起到护肤作用。HA 是皮肤固有的生物物质，当皮肤所含 HA 浓度下降时，可导致皮肤干燥和皱纹的产生，而通过口服或涂抹 HA，可增加体内 HA 及其合成前体，从
18、而有效改善皮肤的保水性和弹性。HA 可维持眼玻璃体呈胶凝状，明显延长泪膜破裂时间，是治疗干眼病的首选药物，还可应用于眼科手术的粘弹性填充剂。HA 在皮肤中可清除阳光长春工业大学毕业论文4中的紫外线照射所产生的活性氧自由基，保护皮肤细胞免受其害，可有效抑制由于自由基侵害而出现的皮肤衰老及色素沉淀的出现，提高皮肤的抗病能力。人们以雄性林蛙皮及摘油后的雌性林蛙皮为原料，采用复合酶解进行天然保湿因子的提取和纯化，最终得到 HA 纯品。HA 目前的市售价格为雄性林蛙及摘油后的雌性林蛙胴体价格的11300倍以上，因此林蛙皮的利用为提高林蛙产品的附加值，实现其高附加值综合利用开辟了一条新途径。(2) 林蛙皮
19、的治疗痤疮功能痤疮俗称“青春痘 ”，是最常见的毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病。中国医学研究表明：痤疮虽生长在皮肤表面，但与脏腑功能失调息息相关；西医认为痤疮与内分泌失调有关，此外与神经精神因素、饮食因素、大便睡眠等个人行为因素、烟酒等嗜好因素、药物因素、化妆品及皮肤护理因素等诱因有关。研究表明，大孔多肽因子为蛙皮的有效成份且具有广谱杀菌的功效，可有效的杀灭由皮肤表层引起的豆口、痤疮而产生的细菌，在加上其保湿因子的作用，使皮肤表面温度上升、表皮角质层柔软、血液的循环得到改善，进而可以达到治疗痤疮、皮肤湿润祛斑的目的。 (3) 林蛙皮的祛斑功能斑是困扰人们的一种皮肤疾病。斑产生可能有遗传、内分泌失调
20、、日晒衰老等多种原因。林蛙皮的透明质酸 HA 在抗氧化试验中表现出了与谷胱甘肽等非酶自由基清除剂相同的作用，所以它具有对理想细胞的保护作用，可以延缓因为自由基的侵害而引起的色素沉着和皮肤衰老，并可以改善皮肤的新陈代谢，以此加速皮肤中黑色素的分解，达到提高皮肤抗病能力的作用，从而具有祛斑的功效。 (4) 林蛙皮的祛皱功能研究结果表明，林蛙皮中胶原蛋白的含量可达 48，而多肽类的含量可达10以上。林蛙皮中的胶原蛋白，经过口服吸收，可以有效的补充人体衰老的肌肤中流失的胶原蛋白，能提高皮肤弹性，并且能减少皱纹生成。此外，林蛙皮中保湿因子-透明质酸 HA 可以有效提高皮肤中保湿因子的含量，增强皮肤的保水
21、性，并能够减少由紫外线照射而产生的自由基损害皮肤，可提高皮肤的抗病能力。综合以上结果，胶原蛋白可以减轻皮肤的衰老症状，使皮肤逐渐恢复原有弹性。 林蛙皮中含有大量的多肽类成分，可以防治自身受感染。它的皮腺内包含各种活性因子，其包括多肽生长因子、保湿因子、血管紧张素因子、林蛙生物抗菌因子、舒缓激肽样多肽、铃蟾肽类因子、吗啡因子、促甲状腺素肽类等 14种多肽类因子。研究表明，林蛙皮当中抗菌多肽有广谱抗菌作用，其包括对革长春工业大学毕业论文5兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌特别对耐药株有明显的抑制作用，还可杀灭皮肤当中各种有害的细菌，有助于减少青春痘生成，并且以不损害真核细胞为前提对癌细胞、病毒和真菌有抑
22、杀作用。亦可用来治疗肠炎、痢疾、胃痛等某些炎症类的疾病。 在世界范围内林蛙油保健效果已得到普遍的共识，林蛙皮当中的活性成分同林蛙油类似，即可促进细胞的修复，亦可延缓组织细胞的衰老。当代研究证明，林蛙皮的成分组成当中含有不同种类的活性因子，它的作用是由一种或几种生长因子协同作用诱导细胞 DNA 的分裂和合成。林蛙皮当中含有蛙皮素，含丰富的脯氨酸抗菌肽可以预防创面感染，它的特点是抗菌谱广，并能在几分钟或几小时内杀死病原菌，且对正常细胞是没有害的。林蛙的活性蛙皮在治疗创伤的过程中，即有抗感染又有止痛、止血、透气、保湿和隔绝创面的作用，可以代替传统的敷料，一方面主动参与，促进创面愈合；同时，可以覆盖创
23、面，是一种新型的胶体生物敷料。成纤维细胞作为机体内极为重要的一种细胞，在创伤愈合和组织修复等过程中起着至关重要的作用。随着年龄的增长人体内透明质酸 HA 的含量逐渐降低，极可能与老化时皮肤弹性的下降有关。林蛙皮当中胶原蛋白的含量可达到48%，多肽类得含量可达到 10%以上，透明质酸（HA）的含量极为丰富，这几种成分则是成纤维细胞生长繁殖所必需的基质。人类的皮肤内透明质酸 HA 伴随着衰老，特别是光导致的老化，透明质酸（HA）的含量会逐渐减少，同时皮肤的保湿能力也有所下降。在机体内透明质酸 HA 以它特有的理化性质和分子结构成就了很多重要的生理功能。它具有特殊的持水作用，是当前发现的在自然界中保
24、湿性最佳的一种物质，故被称为理想天然保湿因子（NMF)。人类皮肤的成熟和老化过程亦随着透明质酸（HA）的新陈代谢和含量多少而变化，适当的补充透明质酸（HA）可以改善皮肤的营养代谢，从而使皮肤去皱、光滑、柔嫩、提高弹性、预防皮肤衰老。通过研究可知，林蛙皮的提取液能显著提高成纤维细胞增殖，其中透明质酸 HA 成分极可能起重要作用，从而进一步证明林蛙皮可以促进伤口愈合、恢复衰老皮肤的弹性以及治疗烧伤等过程作用机制，成为林蛙皮应用于临床的理论根据。2.1.2 林蛙皮中胶原蛋白林蛙皮中的胶原蛋白：胶原蛋白是一种生物性高分子物质，英文学名Collagen。在动物细胞中扮演结合组织的角色。为生物科技产业最具关键性的原材料之一，也是需求量十分庞大的最佳生物医药材料。其应用领域包括生物医药材料、化妆品、食品工业、研究用途等。 林蛙皮中含有许多生物活性物质，其中胶原蛋白就是其中之一，且含量十
