1、分子生物学知识点总结1. 蛋白质组(proteome)：proteins expressed by a genome, 即基因组表达的全套蛋白质。蛋白质组学（Protemics）则是以蛋白质组为研究对象，从整体角度，分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学。 （相互作用网络 PPI）2. 表达蛋白质组学研究的基本流程：蛋白样品的制备及定量-总蛋白的双向凝胶电泳（染色）-凝胶分析软件分析-胶内酶解（胰肽酶）-质谱分析（肽质量指纹图谱）-数据库搜索鉴定蛋白性质3. 双向凝胶电泳：相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，先经等电聚焦电泳(isoelectric focu
2、sing， IEF)，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）把复杂的蛋白质成分分离。4. 比较蛋白质组学：通过比较同一个体肿瘤细胞（组织）与正常细胞（组织）之间蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，发现与肿瘤发病或者发展有关的分子标记，用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白。5. 软电离：所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。6. 肿瘤血清蛋白质分析方法（tumor serologic proteome analysis， SERPA）：是从肿瘤免疫学观点出发建立的一种蛋白质组学和肿瘤免疫学相结合的方法。SERPA其实验过程如下：双向电泳分离肿瘤组织（
3、细胞）总蛋白质；转膜；建立 western blotting蛋白质印迹反应图谱（与患者或正常人血清反应）；软件分析确定差异反应的蛋白质斑点；质谱鉴定和生物信息对肿瘤组织平行胶(replica gel)中相应的差异蛋白质点进行鉴定，筛选出肿瘤分子标志物；用 ELISA、免疫组化等方法对该分子标志物进行原位验证，或者进一步分析该蛋白功能，研究其在肿瘤进展中发挥的作用。7. 蛋白质芯片：是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。8. 功能蛋白质组学：是指对蛋白质间、蛋白
4、质与 DNA/RNA间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。研究方法主要有： 蛋白质芯片技术目前常用蛋白质芯片有：1. SELDI-TOF-MS蛋白质芯片2. 抗体芯片3. 靶蛋白质芯片4. 液相蛋白质芯片 噬菌体展示技术 酵母双杂交系统 免疫共沉淀9. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。10.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：根据蛋白质分子量不同分离复杂蛋白质成分
5、。1.制备凝胶试剂：丙烯酰胺（单体） ；亚甲双丙烯酰胺（胶联剂）二者比例 29 ：1；母液浓度 30%；过硫酸铵（引发剂 引发交联） ； N,N,N,N-四甲基乙二胺（ TEMED） (加速剂)十二烷基磺酸钠（SDS）（阴离子变性剂）2.蛋白上样缓冲液 3.电泳缓冲液 4.考马斯亮蓝 R250染色液 5.脱色液11.Western blotting基本原理:将 SDS-PAGE分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上,在膜上进行固相免疫化学染色,原位显示蛋白质带,从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析。12.Southwestern blo
6、tting基本原理:细胞核蛋白提取物经 SDS-PAGE后,转移至 NCM上,然后用标记的 DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。细胞死亡形式 表现Cell death细胞坏死Apoptosis PCD:细胞生命现象不可逆的停止细胞结构和功能的不可逆丧失。 细胞死亡并非与机体死亡同步。正常组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。细胞受到外来的急性的强力的致病因素作用下，细胞正常代谢活动被强行中断而引起的“意外”的、被动性死亡过程；只见于病理情况下。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。核染色质随机降解呈絮状, 蛋白合成减少。细胞膜、溶酶体破裂, 细胞内容物流出,引起周围炎症指在一定的生理和病
7、理条件下，多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制并遵循一定程序的细胞主动性死亡过程. 又程序性细胞死亡 (programmed cell death,PCD).凋亡小体：胞膜皱缩内陷、反折，包围凝集断裂的染色质、胞质、细胞器等形成芽状、泡状突起并分离脱落，形成一些有膜包被，内涵物不外溢的小块，称凋亡小体（apoptotic body）。多细胞生物体在生长发育过程中，细胞在基因调控下，按照一定时空顺序发生的受到严格程序控制的生理性死亡。 “特殊的定时自杀”PCD Apoptosis功能性概念 发育学概念 形态学概念仅存在于发育细胞 可存在于发育和成体细胞大部分凋亡是 PCD。PC
8、D 的最终结果是凋亡某些凋亡是非程序性。 如细胞毒物诱导的凋亡13. 凋亡的生物学意义 1、确保正常生长发育、2、维持内环境稳定、3、防御功能14. 细胞凋亡的形态学特征：细胞皱缩;2.细胞质浓缩;3.染色质边集核膜下，呈块状、新月形，4.凋亡小体形成；5.凋亡小体内有结构完整的细胞器。细胞凋亡的生化特征：染色质 DNA片段化内源性核酸内切酶活化，将核小体间的连接 DNA降解，形成长度为180200bp 整倍数的寡聚核苷酸片段。在琼脂糖凝胶电泳中呈特征性的“梯状”条带（DNA ladder：细胞凋亡时DNA在核小体间断裂 (DNA fragmentation ) 形成一些 DNA片断，经过提取
9、和纯化后在凝胶电泳上产生 n条梯状条带，故称之为 DNA Ladder，是判断 DNA损伤的重要标准）15.Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用的，活性中心富含半胱氨酸的蛋白水解酶。 Caspase功能：1.细胞骨架蛋白和核纤层蛋白，导致细胞解体成凋亡小体 2 激活 DNA酶（Caspase-activated DNase，CAD） 。CAD:Caspase 激活的DNA酶正常情况下 CAD与其抑制剂 ICAD结合，在胞质内，无活性。凋亡时Caspase水解 ICAD, 游离的 CAD有活性，进入胞核，切割 DNA。3 灭活凋亡抑制物: 如
10、Bcl-2、 ICAD4 水解与 DNA损伤修复相关的酶和蛋白质如聚 ADP核糖多聚酶（poly-ADP-ribose polymerase,PARP）16.死亡受体途径-外源性途径：死亡受体 TNFR1、Fas、CAR1、NGFR、DR3、DR4、DR5 等是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白。通路（pathway）死亡配体（细胞外）-死亡受体（细胞膜）-相关蛋白（中介蛋白，细胞质内）-激活 Caspase8激活 Caspase3-细胞凋亡17.线粒体损伤途径-内源性途径：线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心。释放细
11、胞色素 C（Cyt.c ）释放凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）和限制性核酸内切酶 G（Endo G）释放 Smac/Diablo (the second mitochondria-derived activator of caspase,Smac)(direct IAP bingding protein, Diablo) 释放活性氧 ROS18.细胞周期：1.G1期（first gap） 从有丝分裂到 DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成 RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成 RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义
12、在于为下阶段 S期的 DNA复制作好物质和能量的准备。2.S期（synthesis） 即 DNA合成期，在此期，除了合成 DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA 复制所需要的酶都在这一时期合成。3.G2期（second gap）期为 DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA 合成终止，大量合成 RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。4. M期：细胞分裂期。19.细胞周期蛋白或周期素（Cyclins)：一类结构类似、能结合并调节 CDK活性的蛋白家族，哺乳动物至少有 10种，14 个成员（cyclin A、B1-2、C、D1-3、E、F、G1-2、H、I、K） 。cyclins
13、-CDKs-CKIs 系统20.HIF-1a：几乎参与了对糖酵解每一步的调控；PI3K/Akt 途径；Myc；P53 等21.Cyclin：周期素/周期蛋白，是 CDK（周期素依赖的蛋白激酶）的调节亚基，分别在细胞周期的不同时期积累，激活 CDK，使其具有催化关键底物的磷酸化修饰并调节其活性。参与细胞周期中不同时相的调节。22.G1/S检验点：在酵母中称 start点，在哺乳动物中称 R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的 G1进入 DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？23.cyclin box：各类周期蛋白均含有一段
14、约 100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cyclin box)，是与 CDK相互作用的活性区域。24.RNA干扰(RNA interference ，RNAi )是将双链 RNA导入细胞内引起特异基因的 mRNA降解的一种细胞反应过程。属于转录后基因沉默的一种。25.试述 CDK1活性的调控机制？CDK的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调节。激活因素中，目前认为 CDK与周期素的结合以及保守的苏氨酸残基的磷酸化是较为重要的两种调节因素。抑制因素中，CDK 的 N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的结合是主要的调节因素。磷酸化修饰的激活作用：CDK 的激活还必须依赖于其保守的苏
15、氨酸残基的磷酸化，如在人 CDK1（p34cdc2）的Thr161和 CDK2的 Thr160的磷酸化，就与这两个酶的激活相关。催化 CDK1和 CDK2磷酸化的酶是 CAK（CDK activiting kinase） ，是另一种蛋白激酶CDK7-Cyclin H复合物。当磷酸酶-1 将此位点的磷酸水解，P34cdc2 又失去激酶活性。磷酸化修饰的抑制作用在人的 CDK1和 CDK2中，Thr14 和 Tyr15残基的磷酸化可抑制 CDK的催化活性。催化 Thr14和 Tyr15磷酸化的是两种不同的蛋白激酶，使 Thr14磷酸化的为蛋白激酶 Myt1 ，使 Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Wee
16、1/Mik1。催化 Thr14和 Tyr15脱磷酸化的是蛋白磷酸酶 CDC25。26.DNA损伤又称基因突变：是 DNA复制过程中发生的 DNA核苷酸序列的改变，从分子水平看是 DNA分子碱基顺序或数目的改变。突变的形式包括：替换、插入、缺失、重排。27.突变形式：（一）点突变：指 DNA分子上一个碱基对的变异，碱基替换包括：转换（同型） 、颠换（异型）典型疾病：镰刀型细胞贫血，碱基颠换AT-TA；（二）插入和缺失-框移突变（frame-shift mutation）: 缺失和插入引起的三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸种类、排列顺序发生改变。(地中海贫血)（三）重排：指 DNA分子内
17、发生较大片段的交换，也称重组。移位的 DNA片段可在新位点颠倒方向反置（倒位） ，也可在染色体之间发生交换重组。 突变的意义：产生新基因，出现新性状，为生物进化提供了最原始、最根本的的材料，是进化的分子基础28.DNA损伤的修复：指针对已发生的缺陷而进行的补救机制。直接修复：修复酶识别出损伤部位直接修复，不用切除 DNA或切除碱基。包括1.光修复、2.链断裂的直接重接、3.碱基的直接插入、4.转甲基作用切除修复(excission repair)：在 DNA内切酶、外切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶等多种酶的共同作用下，先将 DNA受损的单链部位切除，然后以另一条链为模板，合成一段正确配对
18、的碱基序列来修补缺口。DNA 损伤最普遍的修复形式。切除修复的特点：（1）切除修复利用的是化学能 ATP，也叫暗修复。 （2）修复发生在复制前。 （3）修复的对象是亲代 DNA。重组修复：当 DNA损伤较大、较严重，无法及时修复或缺乏切除修复酶系统，可跳跃损伤部位复制，子链形成缺口，复制结束后，在重组基因 rec编码的酶（Rec 蛋白） 、DNA 聚合酶、DNA 连接酶等的作用下，将无损母链的 DNA片段移到子链缺口，进行重组修复。发生在复制后，故又称“复制后修复”DNA损伤重组修复的过程及特点：过程：（1）复制：损伤母链复制时，越过损伤部位，子链对应位点留下空缺；无损母链复制成完整双链。(2
19、)重组：空缺诱导产生重组酶(Rec 蛋白)， RecA与空缺区结合，并催化子链空缺与无损母链相应片段重组交换(RecBCD 蛋白);有缺子链与无损母链重组，空缺转移到无损母链，有缺子链完整，损伤母链仍然保留。 (3)再合成：转移后的母链空缺以新的互补子链为模板，在 DNA聚合酶和连接酶的催化下，重新修复缺口;DNA链的损伤并未除去，随着复制的继续，损伤链将在群体中逐步“稀释” 。修复发生在复制后，对象是子代 DNA.SOS修复：DNA 严重损伤难以复制或 DNA复制系统受抑制的紧急情况下，为了保证 DNA链的完整性，应急产生校对功能低的修复酶，采用填补任意碱基的修复方式。这是具有差错的修复，是
20、对极为不利的外界环境的应急反应，故称 SOS修复，也称差错倾向修复。SOS 反应广泛存在于原核生物和真核生物。细胞能存活，但变异率高，DNA 保留错误较多，会引起广泛、长期的突变。自然界也因此而变得生物种类繁多。信号转导通路29.受体：是细胞膜上或细胞内可以特异地识别与结合化学信号物质（配体）并能激发靶细胞产生特异生物效应的特殊蛋白质分子。G蛋白：广义的 G蛋白是指所有能与 GTP或 GDP结合的蛋白质。细胞信号转导中扮演重要角色的 G蛋白主要有两类：异三聚体 G蛋白（与膜受体偶联，位于细胞膜内侧，由三个亚基组成，一般称为经典 G蛋白或大 G蛋白。 ） 、单体 G蛋白（存在于不同的细胞部位的小
21、分子量 G蛋白，也称为“小 G蛋白” ，是单亚基蛋白。Ras 是第一个被发现的小 G蛋白。 ）SH2结构域：由约 100个氨基酸残基组成，中心为反向平行的 片层结构，两侧为 螺旋。SH2介导信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子的结合，并与磷酸化酪氨酸的磷酸基团结合。这种结合依赖于酪氨酸残基的磷酸化及其周围的氨基酸残基所构成的模体（motif） 。不同的蛋白质分子含有结构相似但并不相同的 SH2结构域，因此对于含有磷酸化酪氨酸残基的不同模体具有选择性。SH3结构域：由 55-75个氨基酸残基组成,形成一个扭曲 桶状结构。SH3 结构域介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子的结合，其亲和力与脯氨酸残基及邻近
22、氨基酸残基所构成的模体序列相关。30.1.简述细胞膜受体的类型及其特征： 2.举例说明 cAMP-PKA信号传递途径。cAMP对肌细胞中糖原分解合成的调节作用肾上腺素分泌，与膜受体结合，通过 G蛋白偶联激活腺苷酸环化酶催化 ATP生成 cAMP，cAMP 通过激活 PKA（依赖 cAMP的蛋白激酶）行使功能，PKA*3.试述 RTKRasMAPK 信号传递途径。该途径的信号分子：生长因子类 EGF、PDGF、IGF、FGF、VGEF 等RTK：受体酪氨酸激酶（与配体结合及受体二聚化/寡聚化使酶激活）Ras蛋白：Ras 蛋白是细胞内的一种小分子单体 GTPase，像其它单体 GTPase和G蛋白
23、三聚体一样，非活化状态时结合 GDP，在外源信号的作用下释放 GDP，结合 GTP，本身即被激活，Ras 蛋白亦具有 GTPase活性，将 GTP水解成 GDP， Ras蛋白本身又回到非活化状态。但 Ras蛋白水解 GTP的速度比 Gs 至少慢 100倍。MAPK：有丝分裂原活化蛋白激酶或微管相关蛋白激酶，属 Ser/Thr激酶，是接受膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的一类重要分子，在多种受体信号传递途径中 具有关键性作用。肾上腺素31.抑癌基因（tumor suppressor gene）：又称为抗癌基因（antioncogene）是一类在正常情况下对细胞增殖有负调控作用，而在两个等
24、位基因都缺失或失活时可促进肿瘤形成的基因。常见的有 p53、Rb、VHL、APC32.p53的功能：（1）抑制 cyclin A的表达；（2）抑制 DNA聚合酶与 DNA复制起始复合物的结合；（3）激活抑制细胞分裂的基因；（4）抑制癌基因对细胞的转化。33.基因诊断:采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA 水平)是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。分子生物学相关实验34.PCR-RFLP：多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析，靶基因 PCR扩增、扩增的 DNA片段限制性酶切图谱（长度多态性） 。主要用于核酸变异性分析与比较。35
25、.PCR-SSCP（诊断有无突变）：聚合酶链反应-单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism)的简称，原理是将经扩增的 DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无突变。广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。并不能鉴别所有的突变。36.PCR-southern blot或 Dot blot技术：是将 PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼 龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，然后放射自显影，来检测有无特定的扩增片段及相
26、对含量，现已广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病原体特异基因等方面的研究及检测。37.核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。38.原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行(in situ hybridization)杂交,叫原位杂交。可用于 DNA、RNA 定位研究。39.DNA印迹技术 (Southern blotting)：Southern 印迹杂交常用于探测 DNA的限制性内切酶图谱。 通过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性内切酶图谱的变化，可判断是否发生了明显的 DNA突变
27、。PCR过程及原理：又叫体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增 DNA模板链的两端形成双链，由 DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。 组成体系：template DNA.at least a couple of primer（长度：20bp 左右;碱基分布:均匀随机，G+C 含量:40-60%;引物自身不存在发卡结构;两个引物间不能互补；引物与非特异靶区段同源性不能超过 70%；5端可修饰（酶切位点）-方便基因隆） ；Taq 酶；四种底物 dNTPs；buffer（包括 Mg2+） 。过程： 变性：将双链 DNA 加热（95）使之变性， DNA 双链变成单链 退火：降低温度至
28、56使引物与模板 DNA单链结合 延伸：将温度升至 72，在 DNA聚合酶作用下，在引物 3端进行延伸，使原模板 DNA的一条链变成两条链。Taq 酶的特性：a) 耐热b)缺乏校正活性(3-5外切酶活性)，相对容易错误掺入c)合成速度:1200bp/mind)在新链 3-端额外加上一个 Ae)有 5 -3 外切酶活性，可以 real time PCR40.DNA芯片技术：是指将许多特定的 DNA片段或 cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。41.基因转移的方法：1.逆转录病毒载体（生物学） ；2.脂质体；3.直接注射；4.受体介导基因转移技术；5.磷酸钙共沉淀法；6.
29、电穿孔法；7.基因枪法；8.显微注射法。42.RNAi（RNA interference）：是指在生物体细胞内，短双链 RNA（dsRNA）引起同源 mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。一种转录后水平的同源靶基因沉默，RNAi 能达到基因敲除的效果。43.SiRNA制备方法比较44. 基因工程一般步骤：1.分离目的基因（化学合成、制备 DNA文库、制备基因组文库、PCR） ；2.DNA 切割（限制性内切酶 vector和目的基因片段） ；3.连接；4.转化：b）E.Coli 细胞转化:CaCl2 法制备感受态细菌a) 真核细胞转化:b) micro-injection (微注射)
30、 (细胞核大)c) 磷酸钙共沉淀法 (贴壁细胞)d) electroporation (电穿孔,电激,电击)(悬浮细胞)e) 基因枪(贴壁细胞/组织块)f) liposome (脂质体)5.筛选重组体：蓝白筛选 (-互补法)；营养缺陷互补法；抗生素抗性互补。gene manipulation45. Expression vector：就是在克隆载体的骨架的基础上增加表达原件，如启动子、目的基因、终止子、标记基因，使目的基因能够表达的载体。46. Plasmid：质粒，指一种小环状 DNA分子，存在与细胞染色体外，能够自主复制产生特定的功能。47. LncRNA：长链非编码 RNA，由基因组编码
31、产生，长度大于 200个核苷酸，没有编码蛋白的能力。48. Palindrome：回文序列，也叫作反向重复序列，指核酸序列的 5-3方向与其另一条链相同。49. CRISPR：是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA或其他外源 DNA的免疫机制， Cas9蛋白有两个核酸酶结构域，可以分别切割 DNA的两条单链。Cas9 先与 crRNA及 tracrRNA结合成复合物，然后通过 PAN序列结合并侵入 DNA，形成 RNA-DNA复合结构，进而对目的 DNA双链的切割，使 DNA双链断裂。50. 基因工程常用的酶：限制性内切酶、反转录酶、Taq DNA polymerase51. 请设计一个 QRT-PCR实验，简述其原理，过程。 （可以结合文献，举例说明） 。
