1、本科毕业论文（20 届）肤悦康熏洗液对变应性接触性皮炎的药效及机理研究所在学院 专业班级 中药学(中药分析与鉴定方向) 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。毕业论文（设计）作者（签名）： 年 月 日 目 录摘要 .I-II1 前言 .12 实验材料 .12.1 试剂 .12.2 仪器 .1
2、2.3 动物 .23 实验方法 .23.1 豚鼠变应性接触性皮炎模型的建立 .23.2 实验分组及给药 .23.3 观察及检测指标 .33.4 统计方法 .34 结果 .44.1 豚鼠皮肤变化 .44.2 生化指标 .54.3 组织病理学观察 .55 结论 .66 讨论 .77 参考文献 .9综述 .10致谢 .19I肤悦康熏洗液对变应性接触性皮炎的药效及机理研究摘要：目的 本实验通过建立豚鼠变应性接触性皮炎模型，观察肤悦康熏洗液对变应性接触性皮炎的治疗作用及探讨其作用机制。方法 本实验以 2,4-二硝基氯苯（DNCB）诱发建立豚鼠变应性接触性皮炎（ACD）模型，外用肤悦康熏洗液及外用泼尼松作
3、对照，观察分组给药后豚鼠背部皮肤红肿程度及组织病理变化，同时用酶联免疫吸附试验（ELISA 法）检测各组豚鼠血清中白介素-2（IL-2 ）、白介素-6（ IL-6）及白介素-10（IL-10）表达水平。结果 ACD模型的豚鼠不同程度地出现皮肤红肿结痂，血清中 IL-2 及 IL-10 浓度下降，而IL-6 则上升，镜下观察未见正常对照组豚鼠皮肤有炎症细胞，DNCB 激发后豚鼠皮肤则见不同程度的表皮细胞变性，说明实验造模成功。给药治疗后，与模型对照组比较，各浓度的肤悦康熏洗液对豚鼠变应性接触性皮炎治疗效果有显著性的的差异，主要表现在豚鼠皮肤的红肿程度减弱，不同程度地改善了表皮细胞炎性，上调了模型
4、动物血清中 IL-2 及 IL-10 水平，而抑制了 上升的 IL-6 水平。结论 肤悦康熏洗液对变应性接触性皮炎有治疗作用，其作用机制可能与抑制 IL-6 及促进 IL-2、IL-10 等细胞因子的释放有关。关键词：肤悦康熏洗液；变应性接触性皮炎；药效研究；作用机理注：本论文题目来源于教师的中山市卫生局医学科研立项项目，项目编号为：2013J103IIEffects and mechanisms of Fuyuekang lotion On guinea-pig allergic contact dermatitisAbstract: Objective To observe the Fuy
5、uekang lotion effects and the mechanism of it on guinea-pig allergic contact dermatitis by establishing allergic contact dematits model. Methods The guinea-pig model of ACD induced by 2,4-dinithochor-benzere (DNCB) was established. Guinea-pig were randomly divided into 5 groups-blank group, DNCB mod
6、el group, low-level and high doses of Fuyuekang lotion and prednisone group. Guinea-pig skin swelling and histopathologies were observed. The serum level of interleakin-2，interleakin-6，interleakin-10 and expression of IL-2, IL-6, IL-10 were detected by the method of ELISA. Results The ACD guinea-pig
7、s had swelling symptoms in varying degrees. The levels of IL-2 and IL-6 were declined, but the level of IL-10 was rose. Inflammatory cells were not visibled under a microscope in the normal control group. The ACD guinea-pigs showed epidermal cell degeneration in different degrees. The results showed
8、 the guinea-pig model of ACD were succeed. After drug administration, there was difference of the effcets between DNCB model group, low-level and high doses of Fuyuekang lotion and prednisone group. Fuyuekang lotion reduced the swelling degree、 improved the inflammatory cells and declined the level
9、of IL-6 in the serum of the ACD guinea-pig, but rose the levels of IL-2 and IL-10. Conclusion Fuyuekang lotion could relieve the inflammation of ACD. The mechanism of its action may be related with inhibiting the release of IL-2, IL-6 and IL-10.Keywords: Fuyuekang lotion, allergic contact dermatitis
10、, pharmacodynamics, mechanism11 前言变应性接触性皮炎（ACD）是迟发型变态反应引起的炎症皮肤病，是 T 细胞介导的针对皮肤接触致敏原的免疫反应，属于 IV 型超敏反应。目前用于控制急性变应性接触性皮炎炎症的药物主要使用抗组胺药物、糖皮质激素、保湿剂外用以及控制反复感染等为主，以达到镇静、止痒和抗炎抗感染的作用。但是以上药物均有副作用，长期使用会降低皮肤的抵抗能力，而中药治疗变应性接触性皮炎有着独特的优势，能通过多种途径，达到祛风利湿、清热润燥、抗过敏的功效，注重整体平衡，副作用小，刺激性较小，从而在根本上治愈变应性接触性皮炎。本文探讨的肤悦康熏洗液为中山市中医院
11、制剂室配制，主要由苦参、芦荟、荆芥、地肤子等中药煎煮而成。本文初步探讨了肤悦康熏洗液对于变应性接触性皮炎的治疗效果，为肤悦康熏洗液的临床应用提供依据，现将研究的实验结果报告如下。2 实验材料2.1 试剂肤悦康熏洗剂（批号：20140924，由中山市中医院制剂室提供）醋酸泼尼松龙注射液（生产厂家：华中药业股份有限公司，生产批号：20140510）TNF-、IL-2、IL-6、IL-10、IL-18 、TXB2、PGE 2 ELISA 试剂盒（Cloud-Clone Corp.）2,4-二硝基氯苯（2,4-dinitroehloro-benzol，DNCB）（厂家：上海远慕生物科技有限公司，实验时
12、用丙酮配成 5%和 0.5%的 DNCB 丙酮溶液）丙酮和甲醛均为 AR 纯，蒸馏水由中山市中医院制剂室提供2.2 仪器Multiscan FC 型酶标仪（美国 Thermo）2Wellwash 洗板机（美国 Thermo）BX-50 型显微镜（日本 Olympus）T2000 型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）MDF-382E（N）超低温冰箱（日本三洋）2.3 动物2.3.1 实验动物普通级豚鼠，白色短毛，45 周龄，250300g，共 60 只，雌雄各半。由广东省实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK（粤）2013-0020。2.3.2 饲养环境均饲养于广东省中山市中医院中药药理实
13、验室。环境温度 1822，相对湿度 4060%，通风良好、环境安静，室内保持明 10 小时、暗 14 小时。动物购进后观察 1 周，实验分组时，每组动物体重差异不超过平均体重的 20%。3 实验方法3.1 豚鼠变应性接触性皮炎模型的建立取豚鼠 60 只，参照文献 1-2受试豚鼠于实验前一天腹部剃毛，面积3cm3cm，作为致敏区，实验当天以 5%DNCB 丙酮液 50uL 外涂剃毛区致敏，一天一次。2 周后，除正常组外其余豚鼠在背部脊柱两侧剃毛，按需要设 1 块3cm3cm 并作好标记作为激发区，以 0.5%DNCB 丙酮液 100uL 涂满激发区激发，正常组涂以相同体积的丙酮 3-4 ，每周
14、1 次，连续 3 次。记录激发后背部皮肤变化。最后一次激发后 48 小时内如有红斑、鳞屑、水肿、抓痕等则表示造模成功。3.2 实验分组及给药末次激发后 24 小时，将豚鼠分为肤悦康洗剂高剂量组（2.4g 生药/ml）；肤悦康洗剂低剂量组（1.2g 生药/ml）；泼尼松龙注射液组（5ml:0.125g ）；3模型对照组；正常对照组。每组 1013 只。每日上午和下午分别于激发区外涂相应的药物 1 次，每次 1 分钟，直至药物吸收；模型对照组、正常对照组外涂生理盐水，连续给药 5 天。3.3 观察及检测指标3.3.1 背部皮肤肿胀度分别观察治疗前（分组后给药前），治疗 5 天后停药 1 天的皮损评
15、分情况。评分标准：0-无可见红斑及水肿；1-勉强可见红斑及轻度水肿；2-粉红色红斑及中度水肿；3-鲜红色红斑及重度水肿；4-非常明显及带痂的红斑及强烈水肿。根据评分结果计算疗效指数。治疗前积分减治疗后的积分，再除以治疗前的积分即为疗效指数。3.3.2 采血及组织病理观察治疗 5 天后停药 1 天，麻醉，腹主动脉取血 6ml，1500rmin-1 离心20min，取出血清置于微量离心管内，-80 度冰箱保存备用。采用双抗夹心法（ABC-ELISA 法）测定 TNF-、IL-2 、IL-6、IL-10、IL-18 、TXB2、PGE2 表达水平。剪下皮损皮肤，采用 10%中性缓冲福尔马林固定液固定
16、，编号备检。在光镜下观察炎症细胞浸润情况，主要指标为：真皮炎性细胞计数：取小块（15mm1 2mm）皮损组织，于 10%福尔马林液中固定，石蜡包埋切片，苏木精-伊红（ HE）染色，分别计数 10 个高倍视野（HPF）真皮炎性细胞数，取其平均值。镜下评分：0-无改变或有少数散在炎症细胞；1-轻度改变，在几个视野可见到少数炎症细胞；2-中度改变，所有视野都可见到少或多的炎症细胞；3-重度改变，几乎全部视野都有大量的炎症细胞；4-严重和强烈的改变，所有视野都可见密集成团的、大量的炎症细胞。3.4 统计方法4采用 SPSS 19.0 for Windows 软件处理，计量资料用（Error!s ） 表
17、示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性者采用 Dunnet-t 检验，方差不齐者进行Dunnet-t检验。病理改变 计数资料采用 Ridit 分析。4 结果4.1 豚鼠皮肤变化2,4- 二硝基氯苯（DNCB）诱发建立豚鼠变应性接触性皮炎模型之后，变应性接触性皮炎模型的豚鼠均不同程度地出现皮肤红肿结痂。皮炎豚鼠皮损见图1。在给药治疗之后，变应性接触性皮炎模型的豚鼠背部皮肤的红肿程度均不同程度地减弱，说明肤悦康熏洗液能够减轻变应性接触性皮炎引起的皮肤红肿结痂症状。泼尼松组作为阳性对照组，其疗效指数高于模型对照组，且与正常对照组比较有显著性差异。与模型对照组比较，肤悦康熏洗液高、低剂量组的疗效指数
18、较之提高，且肤悦康熏洗液高、低剂量组与模型对照组对比有显著性差异，说明肤悦康熏洗液对皮炎豚鼠皮损有修复和改善的治疗效果，既是对变应性接触性皮炎有明显治疗的作用。见表 1。表 1 肤悦康熏洗液对皮炎豚鼠皮损的疗效指数（ XS）组别 N 疗效指数（ %）正常对照组 10 模型对照组 11 28.3315.81泼尼松组 13 86.5427.12*FYK 低剂量组 12 72.9236.78*FYK 高剂量组 13 69.8733.60*注：*表示与模型对照组对比 P0.05。5图 1 接触性皮炎豚鼠皮损情况4.2 生化指标相对于正常对照组中豚鼠血液细胞因子的生化指标，模型对照组中豚鼠血液中 IL-
19、2 和 IL-10 的浓度下降，而 IL-6 的浓度上升，正常对照组与模型对照组之间存在显著性差异，说明了实验造模成功。给药治疗后，与模型对照组比较，肤悦康熏洗液高、低剂量对豚鼠变应性接触性皮炎的治疗效果均有显著性差异，均上调了模型对照组豚鼠血液中的 IL-2 及 IL-10 的水平，而抑制了上升的 IL-6 的水平。见表 2。说明了肤悦康熏洗液的作用机制可能是通过抑制 IL-6 及促进 IL-2、IL-10 等细胞因子的释放来起作用的。表 2 肤悦康熏洗液对皮炎豚鼠血液生化指标的影响（ S）X组别 N IL-2（pg/ml） IL-6（pg/ml） IL-10（pg/ml）正常对照组 10
20、188.5061.61 45.291.99 30.876.49模型对照组 10 52.9923.80 50.626.93 19.243.52泼尼松组 12 131.8078.10* 46.202.07* 25.794.33*FYK 低剂量组 12 92.7332.93* 46.412.82* 25.574.36*FYK 高剂量组 10 55.0715.66 46.151.91* 28.665.48*注： 表示与正常对照组对比 P0.05；*表示与模型对照组对比 P0.05。4.3 组织病理学观察镜下所见，正常对照组豚鼠皮肤未见有炎症细胞，2,4-二硝基氯苯激发后豚鼠皮肤组织病理检查见不同程度的表皮细胞变性，真皮有不同程度的血管扩张、
