1、本科毕业论文（20 届）家蝇幼虫壳聚糖对杨桃保鲜作用的研究所在学院 专业班级 中药学(中药分析与鉴定方向) 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。毕业论文（设计）作者（签名）： 年 月 日目录摘要 .-1 前言 .12 材料与仪器 .22.1 试剂和仪器 .22.2 实验动物、菌种及材料 .
2、33 方法 .33.1 家蝇的饲养与幼虫的收集 .33.2 家蝇幼虫壳聚糖的提取及常数测定 .33.3 家蝇幼虫壳聚糖的降解 .53.4 家蝇幼虫壳聚糖对杨桃保鲜作用的研究 .63.5 家蝇幼虫壳聚糖纸片法抑菌实验 .84 结果 .104.1 家蝇幼虫壳聚糖的提取率 .104.2 家蝇幼虫壳聚糖的吸附显色鉴别结果 .104.3 家蝇幼虫壳聚糖脱乙酰度 .104.4 家蝇幼虫壳聚糖分子量 .104.5 家蝇幼虫壳聚糖保鲜数据 .104.6 家蝇幼虫壳聚糖纸片法抑菌结果 .145 讨论 .16参考文献 .18综述 .21致 谢 .29II家蝇幼虫壳聚糖的提取及其保鲜作用的研究摘要：目的 本实验从家
3、蝇幼虫提取壳聚糖，用木瓜蛋白酶降解得到可溶性壳聚糖。研究了家蝇幼虫可溶性壳聚糖对杨桃的保鲜效果以及其对四种细菌的抑菌作用；方法 本实验提取壳聚糖后，用木瓜蛋白酶降解，研究了家蝇幼虫可溶性壳聚糖对杨桃的保鲜作用，分为空白对照组、1%氯化钙阳性对照组、0.5%壳聚糖组、1% 壳聚糖组和 2%壳聚糖组，测定其重量，观察其成熟程度，9 天后捣碎取汁，测定其维生素 C 含量和总糖含量。研究了此三个浓度对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和伤寒杆菌的抑制作用；结果 家蝇幼虫壳聚糖的提取率约为 29.70%，木瓜蛋白酶降解可得到可溶性壳聚糖。家蝇幼虫可溶性壳聚糖对杨桃有一定的保鲜效果，1%壳聚糖保鲜效果最好
4、，优于阳性对照。家蝇幼虫可溶性壳聚糖对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用，对伤寒杆菌没有抑制作用；结论 研究结果表明，家蝇幼虫可溶性壳聚糖对杨桃有保鲜作用，对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。关键词：家蝇幼虫；壳聚糖；木瓜蛋白酶；保鲜；抑菌IIIStudy on the Extraction and Fresh-keeping of Chitosan From Larva of HouseflyAbstract: Objective The experiment extracts chitosan from larva of housefly, degradation o
5、f soluble chitosan, to study its effect on Carambola fresh-keeping and its inhibitory effect on four kinds of bacteria. Method In this experiment, after extracting chitosan, it was degradation by papain to get soluble chitosan, and then studied its effects of preserving Carambola. The study was divi
6、ded into five groups:blank group, 1%Calcium chloride of the positive control group, 0.5% chitosan group, 1% chitosan group and 2% chitosan group. Every day we measured their weight, observed their maturity, and after 9 days, we broken Caracalla to measure their content of Vitamin C and total sugar.
7、Meanwhile we studied the effects of this three concentration of chitosan to inhibition Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Typhoid bacillus. Results The extraction rate of chitosan from larva of housefly is about 29.70% and papain can degradation chitosan to get the solubl
8、e chitosan. This soluble chitosan has certain effect on preservation of Carambola and 1%chitosan group is the best, which is good than the positive control group. This soluble chitosan also has the ability to inhibition Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus but not to Typhoid ba
9、cillus. Conclusion The research shows that the soluble chitosan from larva of housefly has good effect on preservation of Carambola and has inhibitory effect on Escherichia coli, bacillus coli and Staphylococcus aureus.Keywords: larva of housefly; chitosan;papain; fresh-keeping; microbial inhibition
10、11 前言甲壳素是由 2-乙酰氨基-2-脱氧-D- 葡萄糖的基本单元经 -(1,4)连接而成的聚合物，而壳聚糖则是甲壳素脱乙酰基的产物，又名几丁聚糖、聚氨基葡糖等，其化学结构为带阳离子的高分子碱性多糖聚合物，是至今为止唯一发现的阳离子动物纤维和碱性多糖 1。壳聚糖为类白色无定形、无味无臭的物质，具有很强的吸湿性、良好的成膜性、透气性和生物相容性，目前已作为酶载体、免疫吸附剂和缓释制剂等应用于医药领域，作为絮凝剂和皮革整理剂应用于化工环保领域，作为果汁澄清剂和食品添加剂应用于食品工业领域 2。壳聚糖的制备原料主要来源于水产加工厂废弃的虾壳和蟹壳，通过酸碱法、酶法制得。现如今海洋生物逐渐减少，且不
11、同种类的虾蟹提取壳聚糖的工艺不同，造成了壳聚糖的成本过高，限制其广泛应用。家蝇(Musca domestica)属于昆虫纲(Insecta)，双翅目(Diptera)，家蝇科(Muscidae)，是分布最普遍的家蝇类，在我国大部分地区随处可见，虽然其生命周期短，但具有非常强大的繁殖能力，一般半个月就可完成一个世代。家蝇幼虫又名五谷虫，具有清热、消滞的功效，用于神昏谵语、小儿疳积等症。已有研究表明，家蝇幼虫壳中的甲壳素含量高达 95%，约是虾蟹壳的 6 倍，是潜在的丰富的壳聚糖来源 3。家蝇幼虫来源丰富，其壳聚糖含量更比废弃的虾蟹壳高，加上其壳聚糖的提取工艺较为单一，而且已有实验研究证明其壳聚糖
12、安全无毒，因此是潜在且丰富的壳聚糖资源，应用前景非常广泛。目前，对家蝇幼虫壳聚糖的研究多集中于降血压、降血脂方面，在保鲜方面的研究相对较少。杨桃产于热带亚热带，脆甜多汁，具有很高的营养价值，可清热生津、利水解毒。杨桃果实皮薄、脆、具棱状、易损伤，采摘后容易腐烂，其保鲜技术目前主要是打蜡处理、聚乙烯袋包装和低温保存。这些技术或不卫生或成本太高，所以寻找更安全价低的保鲜技术很有必要。本实验的目的主要是研究家蝇幼虫可溶性壳聚糖对杨桃的保鲜作用，为家蝇幼虫壳聚糖应用于杨桃保鲜提供参考依据。22 材料与仪器2.1 试剂和仪器表 2-1 仪器与材料名称 型号 厂家雀巢全脂甜奶粉 Q/SCQC0015S 黑
13、龙江双城雀巢有限公司纯红糖 QB/T2343.1 普宁市里湖恒丰食品厂碘化钾 分析纯 天津市风船化学试剂科技有限公司碘 分析纯 广州化学试剂厂盐酸 分析纯 广州化学试剂厂氢氧化钠 分析纯 天津市百世化工有限公司冰乙酸 分析纯 天津市百世化工有限公司无水乙醇 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司可溶性淀粉 分析纯 广东台山粤侨试剂塑料有限公司氯化钙 分析纯 天津市百世化工有限公司浓硫酸 分析纯 广州化学试剂厂葡萄糖 分析纯 广州化学试剂厂木瓜蛋白酶 规格：100 万 u/g 上海蓝季科技发展有限公司青霉素 规格：100 万单位 哈药集团制药总厂链霉素 规格：100 万单位 深圳华药南方制药有限公司
14、乌氏黏度计 0.5-0.6mm 上海华科实验器材有限公司可见光分光光度计 721 型 上海精密仪器有限公司气浴恒温振荡器 ZD-85A 江苏金坛市宏华仪器厂超净工作台 ZHJH-C1209C 上海智诚分析仪器制造有限公司3数显电热培养箱 HPX-9162MBE 上海博迅实业有限公司医疗设备厂红外线电热鼓风干燥箱CS101-3ABNR 重庆市永生实验仪器厂2.2 实验动物、菌种及材料 家蝇幼虫，由广东省疾病控制中心提供，医药化工学院分代培养。供试菌种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、伤寒杆菌均由广东药学院医药化工学院实验中心提供，均无杂菌。杨桃，采自广东省潮州市田间，无农药，无保鲜剂。3 方法
15、3.1 家蝇的饲养与幼虫的收集饲料按1：1的比例加入雀巢全脂甜奶粉和红糖，加入适量水搅拌均匀，倒入适量麦麸搅匀，使之含水量约为70%。每次使用前新鲜配制 4。接收来自大学城的少许家蝇幼虫后，放于烧杯中，加入适量新配制的饲料置于密封的铁笼里进行饲养，约6天后幼虫化蛹，3天后羽化，3天后产卵，约18h后变成幼虫，从卵变幼虫、化蛹、羽化成蝇、产卵，以此类推，天气变冷则相应时间延迟。家蝇幼虫化蛹后，将其倒于铁盘中，用镊子和勺子小心地把蛹挑出于小烧杯中，置于铁笼里待其羽化，期间注意补少许水保持水分。幼虫长至一定程度后，也将其倒于铁盘中，用镊子和勺子小心地把幼虫挑出放于培养皿中，用清水洗干净后，包上保鲜膜
16、，置于超低温冰箱中保存。3.2 家蝇幼虫壳聚糖的提取及常数测定3.2.1 取家蝇幼虫壳将家蝇幼虫从超低温冰箱取出捣碎，用离心机进行离心，取上层液，过滤得到家蝇幼虫壳，洗净，干燥。3.2.2 除灰分4将家蝇幼虫壳按（1g：10ml）的比例浸入 2mol/LHCl 溶液中，于恒温磁力搅拌器中速搅拌 1h，抽滤，取家蝇幼虫壳洗涤至中性。3.2.3 除蛋白将除过灰分的家蝇幼虫壳浸入 2.5mol/LNaOH 溶液中，在沸水浴中反应4h，抽滤，再浸入 1.5mol/LNaOH 溶液中，在沸水浴中反应 4h，抽滤，取家蝇幼虫壳洗涤至中性，即得到甲壳素粗品。3.2.4 壳聚糖的制备将甲壳素粗品与 60%Na
17、OH 溶液混合，沸水浴下反应 3h， 抽滤， 洗涤， 重复反应，再溶于 10%醋酸溶液中，于恒温磁力搅拌器上搅拌溶解 1h，过滤，取滤液调其 pH=7，出现絮状沉淀即壳聚糖，离心分离，在 80下干燥，即得固体壳聚糖 5。2.3.5 壳聚糖的吸附显色鉴别取所得的壳聚糖约 0.1g 悬浮于 5.00mL 的水中，加入 0.1mol/L 碘液，放置1min，观察悬浮物的颜色 6。3.2.6 壳聚糖脱乙酰度的测定称量 0.125g 经干燥到恒重的壳聚糖样品，置于 50 mL 烧杯中，分别20.00mL0.1 mol/LHCl 标准溶液，室温下磁力搅拌 1 h，使其完全溶解，加入指示剂 1%甲基橙 2
18、滴，在磁力搅拌器搅拌条件下用 0.1 mol/LNaOH 标准溶液滴定过量的 HCl，当溶液由红色变为黄色即为终点。根据滴定终点时用去的NaOH 的体积，所得壳聚糖的脱乙酰度计算见（公式 3-1） 7。%106.%-2 GVCNH样 品 重 ）（）（ 碱碱酸酸（公式 3-1） 094.2）（值D3.2.7 壳聚糖分子量的测定5取 2.86mL 冰乙酸用蒸馏水稀释至 500.00mL，另取 5.85g 氯化钠用蒸馏水稀释至 500.00mL，按 0.1mol 乙酸-0.2mol 氯化钠（2：1）的比例混合成 0.1mol乙酸-0.2mol 氯化钠溶剂备用 8。取 0.1g 壳聚糖溶于 20mL0
19、.1mol 乙酸-0.2mol 氯化钠溶剂中，用 3 号砂芯漏斗过滤，弃去初滤液约 1.00mL，取滤液备用。过滤期间可先连接装置。取用蒸馏水洗净烘干的乌氏粘度计，在 B 管(有小球的支管)和 C 管上都套上橡皮管，然后将其垂直放入恒温槽，使水面完全浸没 C 球，调节恒温槽温度至（25.00.1）。精密量取 0.1mol 乙酸-0.2mol 氯化钠溶剂10.00mL 移入乌氏粘度计粗管，将粘度计垂直固定于恒温水浴中保温 10min 以上，使管内溶液的温度与水浴温度达到平衡。将 C 管上面的乳胶管用夹子夹住，用吸耳球自 B 管的乳胶管口吸气，使溶剂渐渐上升，直到刻度线 a 以上。此时先放开夹子，
20、再移走吸球，使溶剂在毛细管内自然下落。用秒表准确测量并记录溶液下降时通过刻度线 a 和刻度线 b 之间的时间 T0。以同样的方法测量并记录样品溶液下降时通过刻度线 a 和刻度线 b 之间的时间 T。所得的壳聚糖特征粘数计算见（公式 3-2） 9。GT0ln（公式 3-2）式中：G-样品溶液的浓度， g/mL所得壳聚糖的分子量计算见（公式 3-3）。MK （公式 3-3） 式中： 3-104. 2.3.3 家蝇幼虫壳聚糖的降解将得到的壳聚糖按一定的固液比，加入到pH4.0的醋酸 -醋酸钠缓冲溶液中，配制成底物浓度1%的壳聚糖溶液。配制好的壳聚糖溶液置于烧杯中，恒温水浴中预热。待溶液温度升至为40后，加入木瓜蛋白酶液（壳聚糖与酶的比例为25：1），用玻璃棒搅拌使溶液粘度迅速下降。将溶液置气浴恒温振荡器中继续反应约60min。反应结束后，取壳聚糖降解液加热煮沸5min，使溶液中的酶失
