1、本科毕业论文（20 届）金番止泻胶囊提取物不同比例药效对比研究所在学院 专业班级 中药学(中药分析与鉴定方向) 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文中的所有内容均真实、可信。毕业论文作者（签名）： 年 月 日目 录摘要 .- 1 前言 .11.1 腹泻研究现状 .11.2 金樱根、番石榴叶、茯苓概况 .12 材料与仪器 .22.1 材料
2、.22.2 仪器 .23 方法 .33.1 药物制备 .33.2 止泻实验 .33.3 抗炎实验 .43.4 抑菌实验 .53.5 药物安全性评价 .74 结果 .74.1 抗腹泻作用比较 .74.2 抗炎作用比较 .84.3 抗菌作用比较 .94.4 急性毒性 .135 讨论 .155.1 止泻、抗炎结果分析 .155.2 体外抑菌实验结果分析 .156 结论 .16参考文献 .16综 述 .17参考文献 .23致 谢 .24I金番止泻胶囊提取物不同比例药效对比研究摘要：目的 金番止泻胶囊系用水、醇提取番石榴叶、金樱根、茯苓获得其多糖、鞣质、总黄酮等有效部位，按不同比例混合，评价其有效性及安
3、全性，进行药效对比研究，筛选出最佳比例。方法 采用番泻叶所致腹泻模型，观察自拟药方番樱止泻胶囊提取物不同比例对番泻叶所致腹泻的预防和治疗作用；应用醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进，以及将棉球植入小鼠皮下形成肉芽肿的方法，观察番樱止泻胶囊有效部位不同比例的抗炎作用；以急性毒性实验研究其安全性；通过金番止泻胶囊有效部位不同比例混合对枯草杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌等 4 种常见临床细菌进行纸片扩散法、试管稀释法实验，研究比较不同比例混合药物的抑菌作用。结果 三种比例混合药物对番泻叶所致腹泻均有预防与治疗效果，抗炎效果显著，丙组比例最佳。 三种比例混合药物对金黄色葡萄球菌，伤寒杆菌有抑
4、制作用，丙比例具有较强杀菌作用。 结论 甲乙丙比例混合药物均有止泻、抗炎、抑菌药效，丙比例组（A:B:C:D=4:4:0.2:4）为最佳比例。关键词： 多糖；鞣质；总黄酮；止泻；抗炎；体外抑菌IIA comparative study of Pharmacology and efficacy of A comparative study of Pharmacology and efficacy of different mixed radio among the effective composition of JinFan untiarrheal capsuleAbstract: Objec
5、tive To study the the effective parts of polysaccharide, ta-nnins, flavonoids from JinFan antidiarrheal capsule with water, alcohol extrac- tion of Psidium guajava leafs, Rafdix Rosa Laevigata, poria cocos. This sub- ject research accord- ing to the different mixing ratio effective parts, and com-pa
6、re the pharmacological efficacy conresearch,and selected the best proportion. Methods The secretory diarrhoea model was made with Cassia Angustifolia Extract to o-bserve their anti-diarrhea effect. The anti-inflammatory activities were tested u-sing various inflammatory models including the permeabi
7、lity in- crease of blood capillary by HAc in mice,and the cotton-pellet granuloma of the mice.By JinFa-n antidiarrheal capsule effective parts of different mixing ratio of bacillus subtili-s, e. coli and s. aureus and other four kinds of common clinical bac-teria were disc diff-usion method experime
8、nt.Results Three proportion mixed me- dicine for diarrhea caused by senna have prevention and therapeutic effect.Thr-ee proportion mixed medicine have powerful anti-inflammatory properties and C group works best.Ar-mour ethylene-propylene group have inhibit the growth of bacteria and C grou-p of ste
9、rilization ability is strongest. Conclusion C group （A:B:C:D=4:4:0.2:4） as the best mix pro-portion.Keywords: polysaccharides, tannin, totalflavonoids, cure of Diarrhea, anti-inflammatory, bacteriostasis in vitro.11 前言1.1 腹泻研究现状腹泻（diarrhea)是一种临床常见病、多发病，分急性和慢性两类。急性腹泻是由多种不同原因(如细菌感染、毒素作用、化学物质刺激等)引起的肠道急
10、性弥漫性炎症。为常见急症之一,四季皆可发生, 夏秋之际发病率较高, 以大便次数增多,粪质清稀或如水样为其临床特征 1。慢性腹泻指病程在两个月以上或间歇性在 24 周内的复发性腹泻，可见于肠道感染性疾病、肠道非感染性炎症、小肠吸收不良和运动性腹泻等 2。目前治疗腹泻，一般医院首选抗生素进行治疗，许多腹泻患者也自行选择抗生素，由于滥用抗生素引起的二重感染增多, 抗生素毒副作用也导致疾病的不断出现 3，随着临床上抗生素的滥用，加速了肠道病原菌耐药性的产生，给临床治疗带来困难。吸附剂、或抑制肠蠕动的药物，同时采用补液疗法辅助，以防脱水，虽然可以减轻症状，对于肠道非感染炎症有好的疗效，但对于感染性腹泻患
11、者疗效有待观察 4，且治标不不治本。中医治疗腹泻可以在辨证基础上对症治疗，综合协同，对疾病实现早期干预，减轻患者症状，减弱病原体毒素对人体脏腑器官的损害，具有显著疗效，中药复方治疗腹泻以葛根黄芩黄连汤临床运用较为广泛 5，另还有白头翁汤等，但组方都过于复杂，基本上含有八种以上，甚至十五种以上的药材，原料成本高、制备工艺复杂，不利于稳定性、质量的控制。总之，目前并无治疗腹泻的特效药可用。1.2 金樱根、番石榴叶、茯苓概况 金樱根为蔷薇科植物金樱子（Rosa laevigata Michx）的根, 性平, 味酸涩, 有固精涩肠作用, 主治遗精、遗尿、痢疾泄泻、崩漏带下、子宫脱垂、痔疮、烫伤等 6，
12、临床报道其可治疗细菌性痢疾、小儿脱肛等，水煎剂对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌有很强的抑制作用，很强抗噬菌体作用 7。番石榴（Psidium guajava Linn）为常绿灌木或小乔木，系桃金娘科植物 8，番石榴叶为番石榴的干燥叶及带叶嫩枝，民间常用番石榴叶辅助降糖，治疗急慢性肠炎、痢疾等疾病。番石榴叶提取物通过琼脂平板抑菌实验 9发现其对沙门氏菌、大2肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用。茯苓（Wolfiporia cocos(Schw.) Ryv.&Gibn）是一种真菌类中药，多寄生于松科植物赤松或马尾松等树根上。味甘、淡、平，归心、脾、肾经，具有利水渗湿、健脾和胃、宁心安神等功效。茯
13、苓的主要化学分为多糖，三萜，脂肪酸等，100%水煎剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌等均有抑制作用 10。1.3 本论文研究的意义 金番止泻胶囊选用了我国资源丰富的番石榴叶、金樱根、茯苓三种药材为原料，用水、乙醇提取番石榴叶、金樱根、茯苓，获得其多糖、鞣质、总黄酮等有效部位。方中药味数较少，制备工艺简单，原料成本较低，利于稳定性、质量的控制。2 材料与仪器2.1 材料金樱根药材（批号：20131015，广州致信中药饮片有限公司)、番石榴叶药材（批号：20131015，广州致信中药饮片有限公司）、茯苓药材（批号：20130702，广州康圣药业有限公司）、番泻叶药材（批号：20091101，广
14、州致信中药饮片有限公司）经广东药学院高级检验师田素英鉴定；黄连小檗碱片（国药准字 H37021111，青岛黄海制药有限责任公司 ）；注射用硫酸链霉素（国药准字 H20054140，深圳华药南方制药有限公司）；戊巴比妥钠（批号：020919，北京化学试剂公司）阿司匹林（国药准字 J20130078，拜尔医药保健有限公司）；乙醇（批号：20130110，CP，天津市富宇精细化工有限公司）；乙酸（批号：20130210，天津市富宇精细化工有限公司）；KM 小鼠由广东省中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号 SCXK(粤)2014-1002 。2.2 仪器KQ-500 型超声波清洗器（昆山市超声仪器
15、有限公司）；UV1102 紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司)；SHZ-D()循环水式真空泵(巩义市3英峪予华仪器厂)；CP225D 型电子天平（德国 Sartorius 公司上海恒平科学仪器有限公司）；AUY220 型电子天平（广州仪通仪器仪表有限公司）；JA2003 电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；电热鼓风恒温干燥箱（上海讯能电热设备有限公司）；DFY-400 摇摆式高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；HWS26 型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司， HWS26 型）。3 方法3.1 药物制备金樱根乙醇、水提取物制备：金樱根适量，2 次煎煮，每次用 8 倍水煎煮1
16、h，过滤，合并滤液，浓缩得稠浸膏，再用乙醇（95%）热回流提取，过滤，浓缩、回收乙醇至稠浸膏，合并水、乙醇所提稠浸膏（记为 A）。番石榴叶乙醇水提取物制备：方法同金樱根,得稠浸膏（记 B)；番石榴叶挥发油制备：番石榴叶适量，水蒸气蒸馏法提取挥发油（记 C)。茯苓水提物制备：茯苓适量（粉碎），加水煎煮 2 次，每次 10 倍量、煎煮一小时，过滤，合并滤液，浓缩成稠浸膏(记 D）。将各提取物稠浸膏按甲比例（A:B:C:D=4:3:0.2:2）、乙比例（A:B:C:D=5:4:0.2:2）、丙比例（A:B:C:D=4:4:0.2:4）混合用蒸馏水配置成适宜浓度。3.2 止泻实验3.2.1 预防番泻叶
17、所致腹泻取 1822g 小鼠 50 只，随机分成 5 组, 每组 10 只, 雌雄各半。即: 空白对照组、甲比例药物组（A:B:C:D=4:3:0.2:2）、乙比例药物组（A:B:C:D=5:4:0.2:2）、丙比例药物组（A:B:C:D=4:4:0.2:4）盐酸黄连素组。将以上各组动物称重标记后, 各比例药物组和盐酸黄连素组以 0. 2 mL/ 10 g 灌胃药液，对照灌胃生理盐水,灌胃后正常饮食，连续 7d,末次给药后 30min 后，分别灌胃番泻叶 2gkg-1,(1 mL 相当于 0.3g 生药材),然后将小鼠单个放在垫有吸水纸的鼠笼内, 每隔 1h 换垫纸, 从灌胃番泻叶水浸液时开始
18、计时，记录 14h 内小鼠排稀粪点数, 比较组间不同时间累积腹泻次数( 稀粪点数)及腹泻指数。43.2.2 治疗番泻叶所致腹泻 取 1822g 小鼠 50 只，随机分成 5 组, 每组 10 只, 如上分组，连续灌胃小鼠 6d,第 7d，各组小鼠分别灌胃番泻叶 2gkg-1,(1mL 相当于 0.3g 生药材),然后将小鼠单个放在垫有吸水纸的鼠笼内, 1h 后各组灌胃给药， 每隔 1h 换垫纸,从灌胃番泻叶水浸液时开始计时,并记录 14h 内小鼠排稀粪点数, 比较组间不同时间累积腹泻次数( 稀粪点数)及腹泻指数。观察指标 11: 稀便率: 每只动物所排的稀便数与总便数之比稀便级: 表示稀便的程
19、度）级数： 1 2 3 4污迹直径(cm)： 3统计时先逐个统个每一堆稀便的级数,，然后将该鼠所有稀便级数相加除以稀便次数得稀便的平均级数, 简称稀便级。腹泻指数： 稀便率与稀便级的乘积。3.3 抗炎实验3.3.1 腹腔通透性取体重 18-22g 的健康小鼠 50 只，雌雄各半，随机分为 5 组，每组 10 只，如上分组，连续灌胃给药 8 天，每天一次。于末次给药后 30min，尾静注射 0.5%伊文思蓝生理盐水溶液 0.1mL/10g，随即腹腔注射 0.8%冰醋酸生理盐水0.1mL/10g,20min 后脱颈椎处死，（轻轻揉揉小鼠腹部）剪开腹部皮肤肌肉，用6mL 生理盐水分数次洗涤（用注射器
20、分次吸取生理盐水洗涤）腹腔，用吸管吸出洗涤液，合并后加入生理盐水至 10mL，3000rpm 离心 15min，取上清液于590nm 比色测定吸收度。3.3.2 棉球肉芽肿 取 50 只小鼠，雌雄各半随机分为 5 组，每组 10 只，各组小鼠在腹腔注射戊巴比妥钠（85mgkg -1)麻醉下在腋下皮肤切口，在每只小鼠的腋下处先用碘酒消毒，后用 75%酒精棉球脱碘后，各切开腋下皮肤约 2mm 左右长的纵切口，用眼科镊将 1 个灭菌棉球（每个 10mg 高压灭菌， 50烘箱烤干，然后浸泡青链霉素）植入小鼠腋下，随即缝合皮肤。当天各给药组按剂量灌胃给药，每天51 次，连续 8 天，末次给药后 1h，处
21、死小鼠，仔细剥离并取出棉球肉芽组织，置于干燥箱中 60恒温干燥 6h 后称干重，所得重量减去原棉球重，即得肉芽肿的干重。数据处理方法：采用 SPSS 16.0 统计软件包中多个样本率比较的方法进行统计学分析，计量数据用 s 表示，P 0.05 代表差异有显著性。x3.4 抑菌实验平板培养基的制备：在普通营养肉汤培养液中加入 1.5%-2.5%琼脂粉，置于三角烧瓶中，按（2:100）加水，搅拌使营养肉汤琼脂粉完全溶解，配制成固体培养基。用 PH 试纸测试并用 NaOH 调整 PH，盖橡胶塞，用牛皮纸包扎。置于条件为 103.42 kpa，121高压蒸汽灭菌 20 min。灭菌完毕后，从灭菌器内取
22、出培养基，等培养基冷至 5060 时，在超净工作台内，无菌操作将培养基倾注到无菌空平皿内，直径 90 mm 平皿倾注约 20 mL，直径 75 mm 平皿倾注 15 mL 凝固后即成平板培养基。液体培养基的制备：称取一定量的普通肉汤粉末，加适量蒸馏水中溶解，冷却至室温，用 PH 试纸测试并用 NaOH 调整培养液 PH，过滤分装后放于手提式电热高压蒸汽灭菌器内，升压至 103.43 kPa，温度 121.3 ，保持 20 min。细菌液的制备：取 5 支种斜面细菌管和 5 支肉汤培养基管，左手握持，菌种管斜面朝上位于左侧，肉汤培养基管位于右侧，右手持接种环，经火焰灭菌。试管口迅速通过火焰灭菌；
23、将已灭菌的接种环伸入菌种试管中，挑取斜面上的菌苔少许，取出接种环后迅速将菌种移种到肉汤培养基管；先将接种环的菌种挨着液面的试管壁上轻轻研磨，后直立试管，菌种即混合于肉汤中；取出接种环并在火焰上烧灼灭菌后放回原处，火焰灭菌两试管口后，把棉塞分别塞于原试管，在肉汤培养基试管上记上“菌名，接种时间”的标记。将培养基置于37恒温箱培养 16h。含药纸片制作：取 3 支经灭菌后的试管，分别加入经灭菌的 20 张圆滤纸片和甲比例组、乙比例组、丙比例组、黄连小檗碱药液各 10mL，浸泡 4h 直至药液被完全吸收，纸片直径 4mm，每张纸片吸取药液 500L。纸片扩散琼脂法：无菌操作环境下，用无菌微量加样器吸取 100L 细菌液
