1、本科毕业论文（20 届）大黄总蒽醌的纯化工艺研究所在学院 专业班级 中药学(中药分析与鉴定方向) 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 - I -诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。毕业论文（设计）作者（签名）： 年 月 日- II -目 录摘要 III1 前言 12 材料与仪器 32.1 材料 32.2 仪器 33 方法与结
2、果 43.1 大黄提取液的制备 43.2 供试品溶液的制备 43.3 对照品溶液的制备 43.4 大黄总蒽醌含量的测定 43.5 方法学考察 43.6 DM301 大孔树脂的吸附和解吸附特性 73.7 验证实验 134 讨论 14参考文献 16综述 18致谢 27I大黄总蒽醌的纯化工艺研究摘 要 ：目的：确定 DM301 型大孔树脂对大黄总蒽醌类成分纯化工艺的参数。方法：以大黄中总蒽醌的含量为指标，研究 DM301 型大孔树脂的富集、纯化大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数。结果：DM301 型大孔树脂对大黄总蒽醌有良好的吸附性能。以 10g 大孔吸附树脂为标准量，最佳纯化工艺为药液浓度 0.4g
3、生药材/mL，pH=6，最大上样量为 15-20mL，洗脱剂为 90%乙醇，流速为 2mL/min，用 90%乙醇 80mL 洗脱时可以达到良好的除杂效果。结论：通过DM301 大孔吸附树脂富集、纯化后，大黄总蒽醌的吸附率在 70%以上，洗脱率在 80%以上。说明采用本法富集、纯化大黄总蒽醌是可行的。关键词：DM301 型大孔吸附树脂；大黄总蒽醌；纯化工艺IIStudy on Purification Process of Total Anthraquinones in Radix et Rhizoma Rhei Abstract：Objective：To establish the tech
4、nological parameters of the purifrication process of total anthraquinones in Radix et Riftzoma Rhei with DM301 Maeroreticular Resin. Methods：The adsorptive characteristies and elutive parameters of the process were studied by taking the content of total anthraquinones as marker. Results：DM301 Maeror
5、etieular Resin has good purification process. The appropriate adsorption condition of DM301 Maeroretieular Resin was as follows：Concentration of chemical is 0.4g/mL，pH 6. Its static exchange capacity was 15-20mL. then was washed with 80mL 90alcohol for macroreticular resin，flow rate of 2mL/min.Concl
6、usion：With DM301 Macroreticular Resin to adsorb and purify，the elufive ratio of total anthraquinones in Radix et Rhizoma Rhei was over 80 and the adsorption reached over 70So this process of applying macroretieular resin to adsorb and purify total anthraqulnones in Radix et Rhizoma Rhei is feasible.
7、Keywords：DM301 macroporous resin；total anthraquinone；purification11 前 言大黄属蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎，性寒味苦，是临床常用中药之一。大黄具有泻下、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎等功效 1，近期研究发现大黄具有保护大脑皮层神经元的作用 2，对治疗肝性脑病疗效显著 3。大黄中化学成分复杂，有蒽苷、芪苷、鞣苷等，其中蒽苷为最主要成分。大黄中羟基蒽醌衍生物总量约为25
8、，分为游离蒽醌和结合蒽醌，包括大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素及其苷等 4。传 统 分 离 提 取 大 黄 总 蒽 醌 有 明 胶 沉 淀 法 、 醇 调 pH值 法 、 聚 酰 胺 法 等 ，大黄提取的传统方法存在着有效成分损失大，周期长，工序多，提取率低等问题。近年来，大孔吸附树脂在中药的提取、分离、富集方面广泛运用，不断受到药学研究者的关注。大孔树脂是 20 世纪 60 年代发展起来的一种新型吸附剂，既有物理吸附作用，又因多孔状结构而有筛选作用 5，在中药有效成分分离提取的应用中，呈现出良好的发展势头。大孔树脂吸附纯化中药的有效成分效果受 PH、上样量、洗脱剂等多方面因素的
9、影响，因此大孔树脂在纯化有效成分必须寻找最佳的工艺参数。D M301 型 树 脂 是 一 种 中 等 极 性 的 树 脂 ， 在 分 离 黄 酮 类 、 生 物 碱 、 蒽醌 类 等 成 分 有 较 为 明 显 的 分 离 效 果 。 DM301 型 树 脂 用 于 大 黄 中 总 蒽 醌 类 物质 的 纯 化 与 其 工 艺 参 数 的 研 究 却 尚 未 见 报 道 。 本 实 验 通 过 对 提 取 液 pH、 提取 液 浓 度 、 最 大 上 样 量 、 洗 脱 液 浓 度 、 洗 脱 流 速 、 洗 脱 用 量 等 方 面 的 考 察 筛选 出 适 合 分 离 纯 化 大 黄 总 蒽
10、 醌 的 静 态 和 动 态 吸 附 工 艺 ， 从 而 为 日 后 制 备 成 各类 剂 型 提 供 实 验 依 据 。大 黄 是 一 种 多 年 生 草 本 植 物 。 我 国 有 大 黄 45 个 品 种 和 两 个 亚 种 ， 但 载入 药 典 可 以 药 用 的 只 有 3 种 ， 即 正 品 大 黄 、 唐 古 特 大 黄 及 药 用 大 黄 的 干燥 根 及 根 茎 。 神 农 本 草 经 中 记 述 ： 大 黄 ， 味 苦 寒 ， 归 胃 、 肝 大 肠 经 。 主下 淤 血 、 血 闭 寒 热 、 破 症 、 积 聚 、 留 饮 宿 食 、 荡 涤 肠 胃 、 推 陈 致 新
11、 、 通 利 水谷 、 调 中 化 食 、 安 合 五 脏 。 目 前 对 大 黄 有 效 成 分 的 药 理 作 用 研 究 主 要 集 中 在2蒽 醌 类 化 合 物 。 20 世 纪 80 年 代 以 来 ， 国 内 外 对 中 药 大 黄 ， 尤 其 是 其 有 效 成分 的 药 理 作 用 进 行 了 深 入 研 究 。 大 黄 具 有 泻 下 作 用 ， 主 要 作 用 成 分 为 蒽 醌 类化 合 物 ， 其 中 以 番 泄 苷 的 作 用 最 强 ， 周 氏 等 6认 为 番 泄 苷 水 解 后 生 成 大 黄 酸蒽 酮 而 起 泻 下 作 用 ； 大 黄 对 多 种 细 菌
12、均 有 不 同 程 度 的 抑 制 作 用 ， 钱 氏 7用大 黄 醇 提 片 治 疗 急 性 肠 炎 54 例 、 急 性 细 菌 性 痢 疾 110 例 ， 总 效 率 95%；大 黄 还 可 治 疗 慢 性 肾 衰 ， 研 究 发 现 ， 大 黄 能 改 善 氮 质 血 症 ， 影 响 残 余 肾 组 织代 偿 性 肥 大 ， 降 低 残 余 肾 的 高 代 谢 状 态 ， 纠 正 脂 代 谢 紊 乱 ， 减 少 蛋 白 尿 ， 抑制 肾 小 球 系 膜 细 胞 的 增 值 8； 有 研 究 表 明 大 黄 的 不 同 成 分 对 细 胞 内 游 离 钙 水平 的 影 响 不 同 ， 直
13、 接 提 示 了 大 黄 对 肝 细 胞 的 功 能 具 有 多 种 调 节 作 用 9； 大黄 能 使 损 伤 局 部 的 血 管 收 缩 ， 血 管 通 透 性 降 低 ， 从 而 使 出 血 时 间 缩 短 10，达 到 止 血 的 效 果 ； 大 黄 具 有 清 热 下 火 的 作 用 ， 其 作 用 机 理 为 ： 大 黄 可 以 降 低感 染 家 兔 第 三 脑 室 灌 流 液 中 PGE 含 量 ， 影 响 中 枢 环 核 苷 酸 的 水 平 ， 从 而 达到 降 温 作 用 11， 夏 氏 12应 用 大 黄 治 疗 l7 例 急 性 胰 腺 炎 高 热 患 者 ， 均 于 3
14、-7d 体 温 恢 复 正 常 ； 倪 氏 等 13利 用 实 验 得 到 大 黄 酸 可 显 著 抑 制 巨 噬 细 胞 内 白三 烯 B4、 白 三 烯 C4 的 生 物 合 成 ， 因 此 认 为 大 黄 酸 显 著 影 响 巨 噬 细 胞 脂 类 炎性 介 质 活 化 过 程 ， 可 能 是 大 黄 的 抗 炎 作 用 机 制 之 一 ； 此 外 ， 大 黄 还 具 有 抗 肿瘤 作 用 ， 主 要 通 过 抑 制 肿 瘤 细 胞 的 增 生 、 促 进 细 胞 凋 亡 ， 抑 制 细 胞 色 素P450(CYP1A1)和 抗 突 变 作 用 ， 以 及 抑 制 N-乙 酰 转 移 酶
15、 的 活 性 实 现 的 14； 大黄 素 可 促 进 TNF-A 的 分 泌 ， 且 大 黄 素 也 能 抑 制 炎 症 反 应 中 的 NO 的 大 量 合成 和 释 放 ， 提 示 大 黄 素 对 机 体 的 免 疫 功 能 ， 可 能 具 有 双 向 调 节 作 用 15。传统的纯化大黄总蒽醌方法有明胶沉淀法 16、醇调 pH值法 17、聚酰胺法18，这三种方法主要用来除去大黄中的鞣质，但是不能达到很好的分离、富集作用。近年来利用大孔树脂对大黄蒽醌类成分进行纯化富集可达到良好的效果。大孔树脂是20世纪60年代发展起来的一种新型吸附剂，既有物理吸附作用，又因多孔状结构而有筛选作用。在中药
16、有效成分分离提取的应用中，呈现出良好的发展势头 19。袁倚盛等 20用大孔树脂吸附法，使总蒽醌的含量达到50以上，收率较高。金波等 21以大黄总蒽醌的提取率及洗脱率为考察指标，考察大黄的提取条件及3大孔吸附树脂富集、纯化大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数。通过大孔吸附树脂富集与纯化，用70%乙醇洗脱，总蒽醌的洗脱收率在80以上。许汉林等 22比较了D301、AB-8、X-5、NKA-2、H1020型号的5种大孔树脂对大黄总蒽醌的吸附性能；以大黄总蒽醌中的代表成分大黄素为考察指标，结果D301 树脂对大黄总蒽醌的吸附性能最佳。黄园等 23在研究大黄总蒽醌纯化工艺时，采用了 4种方法(明胶沉淀法、醇调
17、pH值法、聚酰胺法以及大孔吸附树脂法)对大黄提取液富集效果进行研究，结果表明大孔树脂对大黄总蒽醌的富集效果最好。王高森等 24以一个含有生物碱、蒽醌、皂苷等由黄连、大黄、知母等药材组成的中药复方为样品，采用4种型号(LD605，F95-34，F95-36，F95-37型) 大孔树脂进行吸附纯化工艺和特性研究。结果表明，上柱药液与上柱体积比以LD605型最高，可达10：1，其余3种树脂体积比仅为LD605型的80-90。对比4种树脂的比上柱量以可溶性浸出物计，以大黄总蒽醌计，LD605型树脂最高。刘峰群等 25以D101型大孔吸附树脂分离大黄中结合型蒽醌提取物，加样吸附1h，以足够量水冲洗吸附柱
18、，流速约lmL/min，至洗脱液几乎无色，改用50的乙醇液冲洗，采用比色法考察总提取物中结合型蒽醌类物质的含量，总收率87.6。2 材 料 与 仪 器2.1 材 料大黄饮片（致信药业有限公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定） ；1，8-二羟基蒽醌对照品（中国药品生物制品检定所，批号 0829-9702） ；DM301 大孔树脂（天津市海光化工有限公司） ，氯仿、甲醇、硫酸、氢氧化钠、95%乙醇均购自天津富宇化学试剂厂，均为分析纯。2.2 仪 器紫外-可见分光光度计(Spectronic GenesysTM2)；旋转蒸发仪 RE-2000（上海亚荣生化仪器厂） ；TC15 套式恒温器
19、（海宁市新华医疗器械厂） ；远红外辐射干燥箱（南通科学仪器厂） ；三角牌电炉（中华人民共和国制造） ；HHS 数显恒温水浴锅；LIBROR AEG-220（日本岛津：0.1mg） 、BP211D（德4国赛多利斯：0.01mg） ；超声仪 CQ200（上海音波声电科技公司） ；旋转蒸发仪 RE-2000（上海亚荣生化仪器厂） ；低温循环水真空泵 DLS2-（巩义予华仪器有限责任公司）3 方 法 与 结 果3.1 大 黄 提 取 液 的 制 备取过 10 目筛大黄药材粉末约 40g，称定，加入 12 倍量的 60%乙醇，加热回流提取 3 次，每次 30min，滤过，滤液减压浓缩至无乙醇味，转移至
20、100mL量瓶中，加水稀释至刻度，制成 0.4g(相当于原药材)/mL 的大黄提取液。3.2 供 试 品 溶 液 的 制 备精密移取大黄提取液 10mL 于 100mL 圆底烧瓶中，加 2.5mol/L 硫酸溶液10mL 和氯仿 10mL，水浴加热回流水解 1h，放冷至室温，将溶液移至分液漏斗，回收氯仿层，酸水层用氯仿洗至氯仿层不显黄色，合并氯仿液，用水洗氯仿液至中性，氯仿液转移至 250mL 圆底烧瓶中，减压回收至干，残渣用 0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解并定容至 10mL，滤过，取续滤液 1mL 置 10mL 容量瓶中，用0.5%醋酸镁 -甲醇溶液稀释至刻度，即得。3.3 对 照 品 溶 液
21、 的 制 备精密称取 1，8-二羟基蒽醌对照品 10.48mg，用氯仿溶解并定容为 100mL的对照品溶液。3.4 大 黄 总 蒽 醌 含 量 的 测 定以 0.5%醋酸镁- 甲醇溶液作为空白对照，在 510nm 处测溶液吸光度，根据标准曲线方程计算总蒽醌的含量。3.5 方 法 学 考 察3.5.1 标准曲线的绘制5将对照品溶液在 400700nm 范围内扫描测定吸收光谱，结果在 510nm 处有最大的吸收峰，如下图 1 所示，故选取 510nm 为检测波长。精密移取对照品溶液 0.2，0.6，1，2，3mL 于 10mL 容量瓶中，挥去氯仿，加 0.5%醋酸镁 -甲醇溶液溶解并定容至 10mL，充分振摇后以 0.5%醋酸镁-甲醇溶液做空白对照，确定 510nm 处为检测波长。图 1 对照品 UV 图谱得出大黄总蒽醌质量浓度与吸光度间的关系如表 1，标准曲线如图 2，回归方程为 y=44.405x+0.0379，相关系数 r=0.9998表 1 大黄总蒽醌质量浓度与吸光度关系1， 8-二羟基的浓度（mg/mL） 吸光度（A ）0.002096 0.1170.006280 0.3260.010480 0.5110.020960 0.9710.031440 1.429
