1、本科毕业论文（20 届）复方葛根桂枝汤中葛根素在大鼠体内的药动学研究所在学院 专业班级 中药学(中药分析与鉴定方向) 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。毕业论文（设计）作者（签名）： 年 月 日II目 录 摘要 .I-II1 前言 .12 材料与仪器 .22.1 材料 .22.2 实验
2、动物 .22.3 仪器 .23 方法 .23.1 药品制备 .23.2 动物分组与处理 .33.3 高效液相色谱-质谱串联法的色谱与质谱条件 .33.4 药动学数据处理 .44 结果 .44.1 HPLC-MS的方法学考察 .54.2 复方桂枝葛根汤的药代动力学研究 .65 讨论 .95.1 测量指标的选择 .95.2 血浆样品的处理 .95.3 检测条件 .105.4 研究结果差异性探讨 .105.5 研究展望 .11参考文献 .12综述 .14致谢 .19III复方葛根桂枝汤中葛根素在大鼠体内的药动学研究摘要：目的 建立HPLC-MS快速测定大鼠血清中葛根素浓度的方法,通过比较葛根素及复方
3、葛根桂枝汤中葛根素的药动学特点，评价复方中其他配伍对葛根素药动学的影响。方法 将大鼠分为葛根素组和复方葛根桂枝汤组，分别于不同时间点采血，用高效液相色谱-质谱串联法测定血浆中葛根素的浓度，采用DAS 2.0软件计算药动学参数。结果 大鼠灌胃给予复方葛根桂枝汤和葛根素后的主要药动学参数：AUC (0-t) 分别为15.10.9 ug/L*h 和 139225.2 ug/L*h，MRT (0-) 分别为8.73.8 h 和5.20.12 h，t 1/2 分别为 6.53.8 h 和3.40.6 h，Tmax分别为1.00 h和 1.61.5 h，葛根素与复方桂枝葛根汤的主要药动学参数具有显著性差异
4、。结论 复方桂枝葛根汤中复杂成分的存在能影响其有效成分葛根素的体内药动学特点。关键词：葛根素；复方葛根桂枝汤；药动学；液质联用IVStudy on Pharmacokineics of Puerarin in Fufanggegenguizhi Decoction in RatsAbstract:Objective To establish a rapid HPLC-MS method for the determination, to compare pharmacokineics of puerarin and Fufangguizhigegen Decoction in rats and
5、 to assess the effect of other components in compound on the pharmaeokineties of puerarin. Methods Rats were divided into puerarin and Fufanggegenguizhi Decoction extract group, blood at different time points. The plasma concentration of the puerarin and Fufangguizhigegen Decoction was analyzed by H
6、PLC-MS. The pharmacokinetics parameters were calculated with DAS 2.0. Results The pharmacokinetic parameters Fufanggegenguizhi Decoction extract and puerarian were as follows AUC(0-t)15.10.9 ug/L*h and 139225.2 ug/L*h，MRT(0-) 8.73.8 h and 5.20.12 h，t1/2 6.53.8 h and 3.40.6 h，T max 1.00 h and 1.61.5
7、h .These parameters have significant difference. Conclusion The complex components in Fufangguizhigegen Decoction can affect the pharmacokinetics of puerarin in rat in vivo. Key words: puerarin，Fufanggegenguizhi Decoction，pharmacokinetic， HPLC-MS11 前言复方桂枝葛根汤处方源于某中医院的经验方，是由张仲景的经典方剂桂枝加葛根汤加减变化而成，由葛根、桂枝
8、、白芍、细辛、羌活等10味中药组成，具有祛风除湿，通痹止痛的作用，临床上用于治疗风寒湿阻型颈椎病。方中葛根为君药，乃发张仲景葛根汤善治“项背强几几” 之意，重用葛根升阳解肌，疏利关节，并引药上行达病所，对改善头痛、眩晕、项强、肢体麻木等症状有效 1；对该复方的研究多是临床病例，临床实践的分析，及临床作用机制的研究。张敏 2通过对桂枝加葛根汤用于治疗颈椎病的疗效观察发现，患者治疗两周后，症状均有不同程度的改善，总有效率达到了92%。刘梅 3等研究发现葛根桂枝汤能上调椎间盘组织Fas表达，下调bcl-2表达，从而发挥延缓椎间盘退变的作用。目前关于该复方的研究多是从整体出发，本实验研究试图通过对单味
9、药的药动学变化研究，来为该复方的配伍合理性，提供依据。葛根素(Puerarin)作为本实验的研究对象，它是从葛根中提取的主要有效成分，具有扩张心脑血管、降低心肌耗氧以及抗肿瘤、抗氧化的作用，临床上主要用于治疗心血管疾病 4-5。复方葛根桂枝汤中，作为研究对象的君药葛根有效成分为葛根素。近年来随着药动学研究的兴起，对于单味药尤其的药动学分析研究较多，有学者用HPLC法测定葛根素在大鼠体内的药动学过程结果表明，大鼠灌胃葛根素后的药-时过程符合二室模型 6-7。而关于葛根素药动学研究概况如下：葛根素吸收较快，但胃肠道吸收程度较差，口服生物利用度较低，大部分经粪便以原型排泄，仅有少部分吸收人血，分布到
10、各组织器官，在肝脏经细胞色素P450代谢 8-9。中药成分复杂，在体内过程尚未阐明，疗效与药效的物质基础及中药制剂用量的三者数量关系不明确，因此对于中药制剂的临床使用，尚存在剂量的安全隐患。对中药制剂进行药动学研究，阐明药效发挥的基础，建立符合中医自身规律的用药原则，为中药制剂安全、合理、有效地用药治疗疾病提供可靠而坚定的基础。在此基础上，我们对复方桂枝葛根汤进行药代动力学研究，而方中的君药葛根主要有效成分为葛根素，故我们选取这该指标对复方桂枝葛根汤进行药代动力学研究。通过比较葛根素在大鼠体内药动学参数，阐明葛根素在2大鼠体内吸收分布过程，为临床合理用药提供理论依据。2 材料与仪器 2.1 材
11、料葛根素由中国食品药品检定研究院提供，规格 20mg/每瓶，批号：HDGGS01。甲醇、乙腈，甲酸为色谱纯，由 MERCK 公司提供。处方中所用的十味药材均购于广东致信药业有限公司。其他试剂均为市售分析纯。实验用水为超纯水。2.2 实验动物SD 大鼠雌雄各半,体重范围：180-220g，来源：广州中医药大学实验动物中心，等级：SPF 级，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0217。2.3 仪器TC-15 套式恒温器（浙江新华医疗器械厂）；东方-A 型电热恒温干燥器（广州东方电热干燥设备厂）；HH-S4 数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；BS224S 型电子天平（北京赛多利斯仪器系
12、统有限公司 d=0.0001）；JJ200 型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；GL-20G-型高速冷冻离心机（上海 Anke公司）。液相-质谱联用分析系统（LC-MS/MS），包括资生堂公司 VP 系列Nanospace S1-2 3301 二元泵和 Nanospace S1-2 3202 在线脱气机（日本），Nanospace S1-2 3133 多用途自动进样器以及 AB 公司 API-4000 Q-Trap 质谱检测器（含 ESI 离子源），色谱柱：Thermo Syncronis-C18 (2.150 mm, 5 m)。3 方法3.1 药品制备3.1.1 复方浓缩物的制备及葛根素对照
13、品灌胃液的制备3取葛根 30g 川芎 10g 桂枝 10g 白止 10g 白芍 15g 防风 10g 细辛 3g 威灵仙15g 羌活 10g 炙甘草 10g 的比例配方，共 246g。按比例加入 8 倍量的水，加热回流提取 12 小时，浓缩药液至 1g/ml 浓度，待用。精密称取葛根素 100mg，用含有 0.3%吐温和 5%乙醇的水溶液，定容至 10ml 容量瓶中，配制为 10mg/ml 葛根素溶液，用于大鼠给药。3.1.2 葛根素工作液及内标标准溶液的配制葛根素工作液的配制：精密称取葛根素 2.23mg，置于 1ml 容量瓶中，加入甲醇定容至 1ml，充分震荡摇匀，得 2.23mg/ml
14、的葛根素储备液，后经一系列稀释成100g/ml，10g/ml，5g/ml,1g/ml,0.25g/ml,50ng/ml，10ng/ml,5ng/ml，2.5ng/ml 浓度的工作液，置于 4下保存备用。内标标准溶液的配制：精密称取对羟基苯甲酸甲酯 1.96mg，置于 1 ml 容量瓶中，加入甲醇定容至 1ml，充分震荡摇匀，得 1.96mg/ml 的内标储备液。后稀释成 100ng/mL 的内标标准溶液，置于 4下保存备用。3.2 动物分组与处理3.2.1 动物分组将大鼠分 2 组，每组 8 只，雌雄各半。第一组葛根素组；第二组复方桂枝葛根汤组。给药前禁食 12 h，饮水自由。葛根素组大鼠按
15、30 mg/kg 的剂量口服给予葛根素，复方桂枝葛根汤组按 5 g/kg 的剂量给予复方桂枝葛根汤。葛根素组在给药前及给药后 0.083，0.33，0.83，1.3，2，4，6，8，10，16h, 24h时间点采血，复方桂枝葛根汤组在给药前及给药后0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8，12h 时间点采血,经眼眶后静脉丛采全血约 0.5 mL，置肝素化试管中，6000 rpm 离心 10 min，分离血浆，-80保存待测。3.2.2 血浆样品预处理采用蛋白沉淀法进行样品前处理，取 100 L 血浆，加入 10 uL 甲醇：水4(1:1)溶液，混合，加入 300 L 含 100n
16、g/mL 对羟基苯甲酸甲酯溶液的甲醇溶液后，充分振荡混匀，于 14000 g、4离心 10 min，取上清液进行分析。3.3 高效液相色谱-质谱串联法的色谱与质谱条件流动相 A 为水相，5% 乙腈（包含 0.1% FA）；流动相 B 为有机相，95%乙腈（包含 0.1% FA）。流速为 0.2 mLmin-1，柱温：室温，采用梯度见下表1。质谱条件，见表 2。葛根素定量分析离子对 m/z:415.2-295.2，IS 定量分析离子对 m/s:151.1-92.1。表 1 待测物和内标的色谱梯度Time Time Events Parameter0.3 Pumps Pump B Conc 150
17、.8 Pumps Pump B Coc. 1003.2 Pumps Pump B Coc. 1003.5 Pumps Pump B Coc. 155.0 Stop - -表 2 待测物和内标的质谱条件Items ParameterScan Type MRM (MRM)Polarity NegatvieIon Source Turbo Spray气帘气 25入口电压 -10出口电压 -7离子源温度 550C雾化气 70辅助雾化气 803.4 药动学数据处理将测得的葛根素与内标的峰面积比值代入由随行的标准曲线拟合而成的一5元一次方程中，计算其浓度，计算平均值。将各组数据代入 DAS 2.0 软件中处理，按二室模型拟合，得各组的药代动力学参数，并计算各药代动力学参数。4 结果4.1 HPLC-MS 的方法学考察4.1.1 专属性实验分别取大鼠空白血浆，空白血浆加标准品和 IS 样品，以及大鼠给药后的血浆样品按照步骤“2.4”项下方法操作处理，测得大鼠空白血浆、含药血浆和服药后血浆典型质谱色谱图，观察大鼠血浆中有无干扰物以及方法的专属性和特异性。如图，表明血浆中内源性物质不干扰样品的测定，葛根素和 IS 在当前色谱条件下峰形良好，单个样品分析时间 5min，葛根素的保留时间约为 2.61 min,内标对羟基苯甲酸的保留时间约为 2.18 min。AB
