1、本科毕业论文（20 届）正交设计法优选石榴皮中总多酚的提取工艺研究所在学院 专业班级 中药学(中药分析与鉴定方向) 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。毕业论文（设计）作者（签名）： 年 月 日目 录摘要 .-1 前言 .12 材料与仪器 .32.1 试剂与试药 .32.2 主要仪器 .3
2、3 方法 .43.1 石榴皮总多酚含量测定方法 .43.2 方法学考察 .53.3 石榴皮中总多酚的提取工艺优化 .64 结果 .74.1 石榴皮总多酚含量测定方法 .74.2 方法学考察结果 .74.3 石榴皮中总多酚的乙醇提取工艺优化结果 .105 讨论 .145.1 提取条件分析 .145.2 石榴皮总多酚的显色条件分析 .155.3 最大吸收波长选择 .165.4 正交试验结果分析 .165.5 其他 .166 结论 .17参考文献 .18综述 .20致谢 .32I正交设计法优选石榴皮中总多酚的提取工艺研究摘要：目的 对石榴皮中总多酚的提取工艺进行研究，并运用正交设计法对其提取工艺进行
3、优选，以获得最佳的提取工艺。方法 以没食子酸为对照，选取磷钼钨酸法对其显色，用紫外分光光度法在 760nm 处测定总多酚的吸光度，再根据标准曲线法计算石榴皮中总多酚的含量。采用 L9（3 4）正交实验设计，以石榴皮中总多酚含量为考察指标，考察乙醇浓度、提取时间、乙醇用量、提取温度 4 个因素对总多酚提取的影响。结果 最佳的提取工艺为固定超声波功率100W，乙醇浓度为 30%，提取温度为 60，料液比为 1:30（gmL -1） ，提取时间为 40min。结论 该工艺经试验含量测定方法简便、准确、重复性好，提取工艺经济、合理，值得进一步推广，对进一步的工艺开发有较好的参考价值。 关键词：石榴皮；
4、总多酚；紫外可见分光光度法；正交设计法IIStudy on the Extraction Process by Orthogonal Design of Total Polyphenols in Pomegranate PeelAbstract: Objective Study on the extractive process of polyphenols quantities and using the orthogonal experimental design method to select the best one. Methods Used gallic acid as a co
5、ntrol matter selected the phosphomolybdic tungstic acid to carry out its color determined the absorbance at 760nm of polyphenols by using the ultraviolet spectrophotometry then calculated the total quantities of polyphenols according to standard curve method. By using the L9(34) orthogonal experimen
6、tal design,method to carry out the experiment and the total polyphenols in the pomegranate peel as a factor observing the ethanol concentration,extractive time,ratio of raw material to solvent and extractive temperature.Results The optimum extraction condition was as follows ultrasonic power of 100W
7、,30% ethanol,extraction temperature of 60,ratio of raw material to solvent of 1:30(gmL-1),extraction time of 40 minutes. Conclutions The content determination method is simple,accurate and reproducible.Extraction which is technology,reasonable and economy worths of further promotion and to the furth
8、er development,it has good reference value.Keywords:pomegranate peel;total polyphenols;ultraviolet spectrophotometry; method orthogonal experimental design11 前言石榴皮(Punicagmnate Peel)系石榴科（Punicaceae ）石榴属（ Punica L.）植物石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮，秋季果实成熟，果皮开裂时采摘，去除种子及隔瓤，晒干或微火烘干。石榴皮是包裹在石榴果实外层的外皮，占石榴的 20%
9、30%，大小不一，厚 1.53mm，为不规则的片状或瓢状。外表面红棕色、棕黄色或暗棕色，略有光泽，粗糙，有多数疣状突起，有的有突起的筒状宿萼及粗短果梗或果梗痕。内表面红棕色或黄色，有隆起呈网状的果蒂残痕。质硬而脆，断面黄色，略显颗粒状。作为传统中药，在中国药典 （2010 年版）第一部记载：“性酸、温、涩；具有涩肠止泻、止血、驱虫等作用。用于久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、白带、虫积腹痛” 。石榴，别名安石榴、榭榴、丹若、金庞、海榴、甘石榴、天浆、若榴等，原产于伊朗及阿富汗等中亚地区，现在主要分布在亚热带及温带地区。据史书博物志记载：“汉张骞出使西域，得涂林安石榴种以归，名为安石榴” 。在中国至
10、今已有 2000 多年栽培历史，常被人们誉为“天下奇果，九州名果” 。石榴果皮和根皮可入药，且是印染和制革工业的原料。我国目前已形成了河南荥阳和开封、陕西临潼、山东枣庄、安徽怀远、四川会理、云南蒙自和新疆叶城8 大石榴主产区，栽植面积达 64668hm2，居世界首位，产量达 38 万多吨 1。随着石榴越来越受到人们的喜爱，石榴已经成为我国重点发展的水果之一，国内外学者对石榴皮的研究也越来越多。有文献报道 2，1929 年，Emanuele Flaccomio 分析了新鲜石榴果皮的成分，石榴皮含鞣花单宁 10.421.3%，蜡 0.8%，树脂 4.5%，甘露醇 1.8%，糖 2.7%，树胶 3.
11、2%，没食子酸 4%等。1963 年，SRajadurai 等 3人又从石榴皮中分析出异斛皮甙和石榴皮碱。1995 年，云南省农科院生物技术研究所 4对蒙自石榴皮的氨基酸组分进行了分析，石榴皮含有多种氨基酸。另外，一系列的实验研究表明石榴皮有凝集精液和体内抗免生育的作用，对生殖器疱疹病毒、淋球菌和白色念珠菌有明显的抑制和杀灭作用，而且没有副作用 5。因此，石榴皮在避孕、控制和治疗性传播疾病方面很有发展前景 6。Saito 等 7从日本上千种药用植物中筛选具有抗氧化能力的可食用植物，结果表明石榴皮提取物列第一，检测表明其抗氧化活性与多酚含量相关。2石榴中多酚物质主要分布于石榴皮中，约为 10.4
12、%21.3%8。石榴皮多酚是一类具有多酚羟基化合物的总称，主要包括鞣质类（水解鞣质）和黄酮类化合物（黄酮醇、黄烷醇、花色苷）等。石榴皮其他的化学成分有甾体类和三萜类、甘油三酯、有机酸和酚酸、脂肪酸和生物碱类。石榴皮多酚作为石榴皮中一种重要的生理活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗突变、抗癌和降血脂等生物学功效，在食品、医药和化妆品等领域有巨大的应用价值 9-11。石榴皮多酚提取方法各异，有直接煎熬提取法，微波提取法，超声波提取法，超临界流体萃取法等，王玲等 12探讨了石榴皮多酚的最佳超声提取工艺条件为：目数为 6080 目，提取功率为 385W。料液比 1:25，提取时间 120s，提取三次，多酚得
13、率高达 21.4%。郭晓萍等 13采用煎熬法提取石榴皮鞣质的工艺为：抽提比 1:40，温度 90，时间 40min，鞣质的含量为 17.3%。姜萍等 14采用超临界 CO2 萃取，得到萃取条件为：温度 44，压力 25Mpa，乙酸乙酯为夹带剂，萃取时间 120min，得率能到 57. 83%。石榴皮总多酚的测定一般是采用分光光度计法，张茜等 15采用的 Folin-酚法对石榴皮提取物中多酚的含量进行测定，以没食子酸的量为对照品。近年来，随着人们对石榴皮营养保健价值的认识，石榴皮的研究成为热点。我国的石榴资源十分丰富，种植面积不断扩大，石榴的综合利用尚有很大的空间，而石榴皮除部分药用外几乎都被丢
14、弃，这造成很大的资源浪费。目前，国内外对石榴皮的研究均主要集中在有效成分的抗氧化作用及其产生的药理活性、药效及作用机制方面。但是，对于石榴皮中多酚类成分（含量为石榴皮干质量的 10%20%）的制备工艺方面的研究极少。而且前期药效试验也已证明，石榴皮多酚含量与其生物活性呈明显的正相关性。为了合理利用这部分废弃资源，更好地开发、利用石榴皮中的多酚，笔者采用紫外-可见分光光度法，以没食子酸为标准品，对石榴皮中的多酚进行含量测定，正交试验优选石榴皮总多酚最佳的制备工艺进行研究，以期为与石榴皮相关的保健食品的研究及资源开发提供理论依据和检测手段。 32 材料与仪器2.1 试剂与试药 没食子酸对照品 中国
15、药品生物制品检定所（批号：MUST1-13040103）石榴皮药材产自山东（20140302） 、广东（20110901） 、湖北（20131201）钨酸钠 天津市科密欧化学试剂有限公司（批号：20130110）钼酸钠 天津市永大化学试剂有限公司（批号：20110615）磷酸 天津市富宇精细化工有限公司（批号：20111130）盐酸 广州化学试剂厂（批号：20140111）硫酸锂 天津市福晨化学试剂厂（批号：20130317）30%过氧化氢 广州化学试剂厂（批号：20140501-1）无水碳酸钠 天津市诺克科技发展有限公司（批号：20130106）乙醇 天津市富宇精细化工有限公司（批号：200
16、80728）超纯水 实验室自制2.2 主要仪器KQ3200DE 型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司UV1102 紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司AUY 型电子天平 岛津（中国）有限公司CP225D 型电子天平（分度值：0.01mg） 德国 Sartorius 公司GZX-9246MBE 电热恒温鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂TC-15 套式恒温器 海宁市新华医疗器械厂WS70-1 型红外快速干燥器 巩义市予华仪器有限责任公司 DFY-300 摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司43 方法3.1 石榴皮总多酚含量测定方法3.1.1 总多酚含量的测定采用磷钼
17、钨酸法 16，以没食子酸为标准品。福林试剂(FC 试剂)的配制：在 1000mL 的圆底烧瓶内加入 50g 钨酸钠、12.5g 钼酸钠、350mL 蒸馏水，85%的浓磷酸 25mL 及浓盐酸 50mL，充分混匀，加热回流 10h，再加入 15g 硫酸锂，15mL 双氧水，然后开口继续煮沸 15min，待双氧水完全挥发，呈亮黄色。冷却后定容至 500mL，过滤，滤液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中，此液放置于冰箱中备用。3.1.2 标准品溶液的制备取没食子酸标准品约 7mg，精密称定，用蒸馏水溶解并定容至 50mL，得浓度为 0.1446 mgmL-1 的对照品储备液。同法制备对照品储备液，没食子酸的
18、浓度为 45.11mgmL-1。3.1.3 供试品溶液的制备取石榴皮粗粉约 0.5g，精密称定，加 40%乙醇溶液 15mL，50超声处理30min，滤过，滤液稀释至 50mL，再取 1mL 稀释至 20mL，作为供试品溶液。3.1.4 选择测定波长精密吸取 0.5mL 的对照品储备液置于 25mL 的棕色容量瓶中，加蒸馏水至 10.0mL，然后分别加入福林试剂 0.5mL，混匀，在 0.58min 内加入 1.5mL20%Na2CO3 溶液，充分混合后定容，作为对照品溶液，30避光放置 1.5h 后置于1cm 的比色皿中，以缺对照品溶液作为空白对照，照分光光度法（中国药典2010 年版附A）
19、 17，在 200800nm 范围内扫描，分析扫描出来的图谱，找出没食子酸对照品的最大吸收波长。5精密吸取 1.0mL 供试品液于 25mL 的棕色容量瓶中，按上显色法操作，找出石榴皮总多酚的最大吸收波长。结合两者的最大吸收波长确定测定波长。3.2 方法学考察3.2.1 标准曲线的绘制分别精密吸取 0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 的对照品储备液，置于 25mL 的棕色容量瓶中，加蒸馏水至 10.0mL，然后分别加入福林试剂0.5mL，混匀，在 0.58min 内加入 1.5mL20%Na2CO3 溶液，充分混合后定容，作为对照品溶液，30避光放置 1.5h 后置于
20、 1cm 的比色皿中，以缺对照品溶液作为空白对照，在选出的最大吸收波长（ 为 760nm）处，测定吸光度，每个样品平行测定 3 次，并绘制标准曲线。3.2.2 精密度试验取石榴皮粉末约 0.5g，精密称定，按“3.1.3”项下供试品制备的方法，制备供试品溶液，于 760nm 波长处，按照标准曲线测定吸光度的方法，测定吸光度，平行测定 6 次。3.2.3 稳定性试验取石榴皮粉末约 0.5g，精密称定，按“3.1.3”项下供试品制备的方法，制备供试品溶液，于 760nm 波长处，分别在 0，0.5， 1.0，1.5，2.0，2.5h 时，按照标准曲线测定吸光度的方法，测定吸光度。3.2.4 重复性试验取石榴皮粉末约 0.5g，6 份，精密称定，按“3.1.3”项下供试品制备的方法，制备供试品溶液 6 份，于 760nm 波长处，按照标准曲线测定吸光度的方法，测定吸光度。3.2.5 加样回收率试验取已知含量的供试品粉末（总多酚的含量为 183.9mgg-1）9 份，每份约为0.5g，精密称定，分别加入对照品储备液，按“3.1.3”项下供试品制备的方
