犬睾酮T酶联免疫分析ELISA.DOC

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资源描述

1、1犬睾酮(T)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用犬血清,血浆及相关液体样本中睾酮(T)的含量。试剂盒性能:1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.95 以上。2.批内与批见应分别小于 9%和 11%检测范围:请来电咨询 保存条件及有效期:1.试剂盒保存:;2-8。2有效期:6 个月注意事项:1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。2 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。3 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好

2、控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。4 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本 OD值大于标准品孔第一孔的 OD 值) ,请先用样品稀释液稀释一定倍数( n 倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(n5) 。5 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。6 底物请避光保存。7 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中犬睾酮(T)水平。用纯化的犬睾酮 (T)抗体

3、包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入睾酮(T),再与 HRP 标记的睾酮(T)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的睾酮(T) 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值) ,通过标准曲线计算样品中犬睾酮(T)浓度。样本处理及要求:1. 血清:室温血液自然凝固 10-20 分钟,离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分) 。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。2. 血浆:应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸

4、钠作为抗凝剂,混合 10-20 分钟后,离心20 分钟左右(2000-3000 转/ 分) 。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。3. 尿液:用无菌管收集,离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分) 。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。24. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分) 。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用 PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20分钟左右(2000

5、-3000 转/分) 。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS(PH7.4) ,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右(2000-3000 转/分) 。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20保存,但应避免反复冻融.7. 不能检测含 NaN3 的样品,因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP )活性。试剂盒

6、组成:试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存说明书 1 份 1 份封板膜 2 片(48) 2 片(96)密封袋 1 个 1 个酶标包被板 148 196 2-8 保存标准品:2700ng/L 0.5ml1 瓶 0.5ml1 瓶 2-8 保存标准品稀释液 1.5ml1 瓶 1.5ml1 瓶 2-8 保存酶标试剂 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存样品稀释液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存显色剂 A 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存显色剂 B 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存终止液 3ml1 瓶 6ml1 瓶 2-8 保存浓缩洗涤液 (

7、20ml20 倍)1 瓶 (20ml30 倍)1 瓶 2-8 保存操作步骤1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔 10 孔,在第一、第二孔中分别加标准品 100l,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50l,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取 100l分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取 50l弃掉,再各取 50l分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取 50l分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50l,混匀后从第七、第八孔中分别取

8、50l加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50l,混匀后从第九第十孔中各取 50l弃掉。 (稀释后各孔加样量都为 50l,浓度分别为 1800ng/L,1200ng/L ,600ng/L , 300ng/L, 150ng/L) 。2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同) 、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40l,然后再加待测样品10l(样品最终稀释度为 5 倍) 。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。3. 温育:用封板膜封板后置 37温育 30 分钟。4. 配液:将 30(48T 的 20 倍)倍浓

9、缩洗涤液用蒸馏水 30(48T 的 20 倍)倍稀释后备用。35. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。6. 加酶:每孔加入酶标试剂 50l,空白孔除外。7. 温育:操作同 3。8. 洗涤:操作同 5。9. 显色:每孔先加入显色剂 A50l,再加入显色剂 B50l,轻轻震荡混匀,37避光显色15 分钟. 10. 终止:每孔加终止液 50l,终止反应(此时蓝色立转黄色) 。11. 测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值) 。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。计算:以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的 OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

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