温度与时间的设置设置变性- 退火- 延伸三个温度点 n 设置变性- 退火- 延伸三个温度点 n 标准反应中采用三温度点法，双链DNA 在90 95 变性，再迅速冷却至40 60 ，引物退火 并结合到靶序列上，然后快速升温至70 75 ， 在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延 伸 n 对于较短靶基因（长度为100 300bp 时）可采用 二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般 采用94 变性，65 左右退火与延伸 变性温度与时间 n 变性温度低，解链不完全是导致PCR 失败的最主 要原因 n 一般93 94 lmin 足以使模板DNA 变性 n 若低于93 则需延长时间 n 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 n 此步若不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性， 就会导致PCR 失败 退火(复性)温度与时间 n 退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素 n 变性后温度快速冷却至40 60 ，可使引物和 模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多， 引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互 补链之间的碰撞 n 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成 及
