1、费氏弧菌发光杆菌污染的检测和判别1 实验器材与试剂1.1 器材高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜、天平、三角瓶、试管、移液管、培养皿、 接种针、平板涂布器、酒精灯、载玻片1.2 试剂 营养琼脂、葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚 红溶液、蒸馏水、番红染液、香柏油、擦镜液1.3 培养基(1)营 养 琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉 4.5g，溶于 100mL 蒸馏水配制，pH7.2，分装到试管中，灭菌后摆成斜面。(2)种子培养基：葡萄糖 0.5%、磷酸二 氢氨 0.1%、七水合硫酸镁 0.02%、氯化钠 0.5%、磷酸氢二钾 0.1%(
2、3)葡萄糖酚红肉汤培养基： 牛肉膏 0.3%、蛋白胨 0.8%、 葡萄糖 0.5%、 氯化钠 0.5%、 0.4% 酚红溶液，pH7.22 实验方法2.1 种子的扩大培养2.1.1 斜面培养基的配制配制营养琼脂培养基，分装，灭菌（121条件下灭菌 30min），倒斜面。2.1.2 菌种的活化将费氏弧菌发光杆菌采用无菌操作的方法接种于斜面上，37 下培养 18h；培养 18h 后， 观察菌落颜色是否一致，若均 为黄色，挑取培养皿周边的菌落进行无菌检测；若颜色有黄有白，则两种颜色的菌落均要进行无菌检测。检测方法常用染色镜检，若检测后，没有污染，便可进行扩大培养；若检测到杂菌，要重复上述步骤，直到无
3、菌为止，否则，不能继续下一步操作。2.1.3 扩 大培养在无菌条件下，从检测后的活化培养基上挑取 10 个左右菌落，用接种针接种到扩大培养基(即种子培养基)中，于 37 下振荡培 16-18h，观察菌落形态。然后配合显微镜形态观察，根据结果来判断能否进行下一步。2.2 污染的检测和判别2.2.1 显 微镜检查取样：用无菌操作方式取发酵液少许,涂布在载玻片上；制片、染色：自然风干后,用番 红染液染色 1-2min，水洗；干燥后用油镜下观察。2.2.2 平板 检查配制营养琼脂培养基，灭菌，倒平板；取少量待检发酵液经稀释 (大约 106107) 后涂布在营养琼脂平板上，在 37下培养 24h；观察菌
4、落形态。2.2.3 肉 汤培养 检查法（用于检测培养基灭菌是否彻底）将 1ml 待测液（灭菌处理后的种子培养基）接入葡萄糖酚红肉汤培养基中，于 37下培养 24h，观察培养基的状态和颜色。3 实验结果3.1 种子的扩大培养观察到在活化培养基上长出大量菌落，且菌落颜色单一，均为淡黄色。挑取边缘菌落及形态一致的菌落少量，制作装片，染色后在显微镜下观察，发现多个视野中都为杆菌，可初步得出活化的菌种中没有污染杂菌。挑取没有污染杂菌的菌落，用无菌操作技术接种，进行扩大培养。在适宜条件下培养 18h 后，得到了费氏弧菌发光杆菌的种子液，吸取该种子液在显微镜下观察到有大量的大肠杆菌。3.2 显微镜检查镜检时
5、，多个视野中均观察到的均为杆菌，呈链状或单个存在，没有观察到球菌或其它形态的的细菌，因此可初步认为该种子液中没有杂菌污染。3.3 平板检查从营养琼脂平板培养基上观察到菌落的形态为圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明或乳白色、菌落上有小的突起，这是典型的大肠杆菌菌落，没有观察到其它形态的菌落，因此可初步认为该种子液中没有杂菌污染。3.4 肉汤检测培养基灭菌是否彻底葡萄糖酚红肉汤培养基中有酚红染液，酚红在酸性环境中呈黄色，碱性环境中呈红色。肉汤培养基中接种的待测液若有菌体存在，则菌体代谢会使培养基呈酸性，显示黄色。该肉汤培养基经培养后，仍呈现红色，没有变为黄色，且澄清，未浑浊，说明待测液中没有菌体存在
6、，因此，所测的灭菌种子培养基中没有被菌体污染。4 实验讨论4.1 在种子的扩大培养前要对菌种进行活化培养以获得有活性的种子，若菌种已活化则可省略这一步。种子扩大培养时，如果低温保藏的菌种污染了杂菌，则应弃去或用平板培养基纯化后再用来活化和扩大培养。4.2 采用显微镜检查法，如果从视野中发现有与目标菌株不同形态的菌体则可认为是污染了杂菌，该法简便、快速，能及时检查出杂菌。但是也有其不足之处：对含杂菌少的样品不易得出正确的结论，故应多检查几个视野；由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意不同生理状态下目标菌与杂菌的区别，必要时可用革兰染色、芽孢染色等辅助方法鉴别；对固形物多的发酵液检查较困难。4
7、.3 采用平板检查法，若出现与目标菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染；若要进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与目标菌相异，则可确认污染了杂菌。此法适于固形物较多的发酵液检测，形象直观，肉眼可辨，不需仪器。但需严格执行无菌操作技术，所需时间较长，而且无法区分形态与目标菌相似的杂菌。在污染初期，目标菌占绝大部分，污染菌数量很少，所以要做比较多的平行试验才能检出污染菌。4.4 肉汤培养检查法只能用来检测培养基的灭菌是否彻底，不适用于发酵液的检查。4.5 可以用发酵参数判断法来检测是否有杂菌污染。即在发酵过程中，以发酵时间为横坐标，以溶解氧或排气中二氧化碳含量或发酵液的 pH 为纵坐标，作曲线，若在工 艺不变的情况下这些特征性曲线发生变化，则很可能是污染了杂菌。但是，发酵参数判断法很难检查出早期的污染菌。5 实验结论本实验我们了解了种子制备的方法和发酵污染的危害，知道染菌不仅浪费大量原材料，造成严重的经济损失，而且污染了环境，所以，在种子活化培养和扩大培养中每一步均需进行无杂菌检查。显微镜直接检查法和平板间接检查法都可以用来检测杂菌污染，方法较为简便、形象直观，但是，若要进行更准确的检测，最好再做较多的平行实验。肉汤培养检查法是用于检测培养基灭菌是否彻底的有效方法。
