1、牛奶中 -内酰胺酶检测方法-高效液相色谱法检测无抗奶“无 抗 奶 ”， 顾 名 思 义 ， 即 不 含 抗 生 素 的 牛 奶 。 早 在 2002 年 ， 这 一 概 念 便被 提 出 ， “无 抗 生 素 ”的 字 样 也 登 上 了 乳 品 包 装 。为 何 牛 奶 含 抗 生 素 ？牛 奶 中 的 抗 生 素 来 自 乳 牛 ， 乳 牛 被 注 射 抗 生 素 ， 主 要 是 治 疗 乳 腺 发 炎 。 乳腺 炎 是 奶 牛 常 见 病 ， 抗 生 素 的 使 用 是 业 内 “公 开 的 秘 密 ”。 牛 奶 中 的 抗 生 素 可能 导 致 饮 用 者 过 敏 ， 或 因 长 期
2、接 触 抗 生 素 而 耐 药 。如 何 做 到 “无 抗 ”？药 品 合 理 间 隔 期 后 才 挤 奶 ， 可 以 生 产 无 抗 奶 ， 可 以 通 过 检 验 抗 生 素 的 方式 验 证 。1、间接法方法原理：利用 -内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的 -内酰胺酶，那么青霉素经 -内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在 -内酰胺酶。实验步骤：称取 20 g 试样，在 4、16000rpm 条件下离心 10 min。取下层清液 10 g 于 50 mL 塑料离心管，并将塑料离心管置于 37水浴锅中振荡孵育 30 min。向孵育后
3、的离心管中加入无水乙醇 15 mL。振荡提取 30 min 后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入 10 mL 磷酸盐缓冲液（pH=8.5 ） ，涡旋 1 min 后调节 pH 为 8.5。以 1 mL/min 的速度将提取液通过经过预处理的 Oasis HLB 固相萃取柱，用 2 mL 磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用 2 mL 水淋洗。最后用 3 mL 乙腈洗脱。将洗脱液在 40下氮气吹干，用 0.025 M 磷酸盐缓冲液（ pH=7.0）定容残渣至 1 mL,待上机测定。色谱条件：LabAlliance PC-2000 高效液相色谱
4、配 2000 型紫外检测器；lanbo 色谱柱 :C18(4.6mm150mm5m)；流动相: 甲醇/0.004M 磷酸二氢钾（pH=4.5）40/60 ；检测波长: 268 nm2、直接法方法原理：牛乳中的青霉素钾在 -内酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出来，经高效液相色谱仪检测确认其是否存在，从而判定该牛乳是否为人造“ 无抗奶 ”。实验步骤：称取 20 g 试样，在 4 、16000 rpm 条件下离心 10 min。取下层清液 10 g 于 50 mL 塑料离心管，加入无水乙醇 15 mL，振荡提取 30 min 后离心，取清液经 0.45 m 的滤膜过滤，用高效液相色谱仪检测。标准溶液配制：称取 0.01 g（精确至 0.001 g）青霉素钾于 100 ml 容量瓶中，加入 1ml 市售抗生素分解剂，室温放置 2h 使青霉素钾酶解完全后用去离子水定容，得到青霉噻唑酸钾标准溶液，浓度 100 g/mL。根据实际情况稀释后使用。色谱条件：LabAlliance PC-2000 高效液相色谱配 2000 型紫外检测器；lanbo 色谱柱 :C18(4.6mm150mm5m)；流动相: 甲醇/0.004 M 磷酸二氢钾（pH=4.5）40/60 ；检测波长: 230 nm
