1、硒增强细胞免疫的研究。硒通过增强抗原递呈促进迟发超敏反应夏汉章 张友会（肿瘤研究所，北京）提要 硒处理小鼠能提高小鼠对致敏剂三硝基氯苯（TNCB ）诱发的迟发超敏反应（DTH ）的敏感性。体外实验证明，经硒处理的小鼠脾脏粘附细胞向 TNCB 致敏的 T 淋巴细胞递呈半抗原三硝基苯基进而刺激 T 细胞增殖反应的能力。即抗原递呈功能比未处理的对照强。正常小鼠的脾脏粘附细胞在体外经硒处理后，其递呈抗原的能力更强。提示硒通过加强抗原递呈细胞的功能实现促进 DTH 反应。关键词 迟发超敏反应 抗原递呈 硒自然界硒分布和机体血硒含量与人类某些肿瘤的发生率成负相关关系 1，硒可抑制某些化学致癌物的致癌效应
2、2。免疫系统的功能与硒的含量相关，多数研究表明，硒可促进机体的体液免疫反应 3，4 ，但有关硒对细胞免疫之影响的报道为数不多。Spallholz 5曾报道硒处理豚鼠可提高动物对二硝基氯苯（DNCB）刺激的迟发超敏反应的敏感性。硒不仅能促进 T 细胞的功能，如细胞毒 T 细胞的活性 6、白细胞介素 2 的分泌 7，也能促进巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤效应 8，消除抑制性巨噬细胞的抑制功能 9。本文报道硒通过增强抗原递呈细胞活性从而加强小鼠的迟发超敏反应。材料与方法动物 健康 BALB/c 小鼠，2-3 月龄，由中国医学科学院动物中心或肿瘤研究所动物室提供。试剂 RPMI1640（GIBCO）培养液含
3、青霉素 100u/ml，链霉素 100u/ml，小牛血清 10%。临用时加新配制的 2-巯基乙醇（ Sigma）510 -5mol/L。致敏剂 1，3，5-三硝基氯苯（TNBS，Sigma ） ，用磷酸缓冲液（ PBS）配成 10mmol/L 的溶液，并用 1NnaOH 调酸碱度至 pH7.4，-20保存。亚硒酸钠（Na 2SeO3）购于北京化工厂。氚-胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR，比活性 25Ci/mmol） ，购于中国科学院原子能研究所。迟发超敏反应 取 0.2ml 7%TNCB，涂在剪除毛发的小鼠腹部皮肤上，使动物致敏。4d 后，在动物左耳壳涂 1%TNCB 刺激。24h 后测量动物左右
4、耳壳的厚度差，来表示迟发超敏反应的强度。对照为未致敏小鼠耳壳厚度差。抗原特异性 T 淋巴细胞增殖反应 半抗原三硝基苯基（TNP）刺激的 T 细胞增殖反应的实验方法见文献 10。用液闪仪（Beckman）测量样品每分钟脉冲数(cpm)。结果用三个重复孔 cpm 的均值表达。0 0.5 5 50 500结 果图 1 示硒对迟发超敏反应（DTH）的影响。以未致敏的小鼠对三硝基氯苯（ TNCB）的刺激为对照，四天前经 TNCB 致敏的小鼠能对 TNCB 的再刺激产生较强的 DTH 反应。如果在致敏的同时经腹腔注射 Na2SeO3 (1mg/kg)，小鼠对 TNCB 刺激的 DTH 反应明显增强，提示硒
5、提高了动物对致敏剂的敏感性。图 2 示硒对抗原特异性 T 淋巴细胞增殖反应的影响。结合半抗原三硝基苯基（TNP）的小鼠脾脏粘附细胞（SAC）能刺激 TNCB 致敏小鼠的淋巴结 T 细胞（LNT）活化，产生强烈的增殖反应，而未结合 TNP 的 SAC 只引起 LNT 轻度增殖。此外如前文所述 10，SAC-TNP 不能刺激 TNCB 非致敏的 LNT 产生增殖反应，而结合 TNP 的脾脏非粘附细胞（SNAC ）也只能刺激 LNT 产生微弱的增殖反应。提示 SAC 在该实验系统中实际起着递呈抗原的作用。25 SACSAC-TNP2060 1550 40 103020 5106 0图 1 TNCB
6、诱导的迟发超敏反应Fig 1 Delayed type hypersensitivity in mouse skininduced by TNCB从图 2 可知，TNP 特异性 T 细胞增殖反应可因 Na2SeO3 的加入而改变，其程度取决于Na2SeO3 的剂量。适量的 Na2SeO3 能促进 TNP 特异的增殖反应，当浓度为 50ng/ml 时，硒可使增殖反应提高 85%。Na 2SeO3 浓度过高（500ng/ml） TNP 特异性 T 细胞增殖反应反而被强烈地抑制。为研究硒在适量的浓度范围内促进 DTH 和抗原特异性 T 细胞增殖反应的机理，实验观察硒对脾脏粘附细胞抗原递呈功能的影响。
7、给小鼠腹腔注射 Na2SeO3（1mg/kg ） ，以未处Na2SeO3 treniment 1mg/kgSensitlzition 7%TNCB 7%TNCBChallengc 1%TNCB 1%TNCB 1%TNCBEarinctcment(0.01mm)图 2 亚硒酸钠对 TNP 特异性增殖反应影响的剂量效应关系Fig 2 Dose-dependent effect of selenium on TNP-specific proliferative response4103 LNT were stimulated by SACor SAC-TNP in the prosence of v
8、arious doses of sodium selenite for thrce days,LNT proliferative response was mensured by 3H-TdR incorporation3H-TdRincorporation(Acpm,10-3) 图 3 亚硒酸钠体内处理对抗原递呈细胞活性的影响Fig 3 The effect of selenium in vivo treatment on antigen presenting cells SAC,obtained from normal mice or mice injected i.p.with sodi
9、um selenite(1mg/kg)4d earlier,was used to stimulate 4105 LNT for three days;proliferation was measured by 3H-TdR uptake by LNT;cpm is the defference between cpm of LNT stimulated by SAC-TNP and cpm of LNT stimulated by SAC理的小鼠作对照，4d 后制备小鼠 SAC 并与 TNP 结合。结果表明，在图 3 所示的 S/R 比值范围内，经硒处理的小鼠 SAC 向 TNCB 致敏的
10、LNT 递呈 TNP 的能力比正常小鼠的 SAC强，引起 LNT 较强烈的增殖反应，提示硒在体内处理动物能使机体的抗原递呈细胞的活性增强。Normal mice35 Micc injeetcd3025201510501/16 1/8 1/4 1/2 S/R表 1 经硒处理的巨噬细胞递呈抗原的能力Table 1 Antigen presentation capacity of macrophagesPretreated with seleniumStimulating cells Na2SeO3 treatment* TNP-coupled LNT proliferation (3H-TdR u
11、ptake,cpm)*- - - 43233SAC,104 - - 66340SAC,104 - + 7392503SAC,104 250ng/ml + 245731297SAC,104 500ng/ml + 389851842SAC,104 1000ng/ml + 181322252SAC, 5104 - - 1615210SAC, 5104 - + 162872357SAC, 5104 500ng/ml + 400091486SAC, 5104 1000ng/ml + 247171943*SAC were pretreated with selenium for 1h,washed thr
12、ee times with PBS and then coupled with TNP;*4105 LNT were stimulated for three days by SAC or SAC-TNP and cell proliferative response was measured by 3H-TdR incorporation by LNT同样，用较大剂量的 Na2SeO3 在体外短时间内（1h）直接处理过的正常小鼠的 SAC 比未经处理的 SAC 的抗原递呈活性增强，使 T 淋巴细胞产生较强烈的增殖反应（表 1） 。尽管在培养过程中加入 500ng/ml Na2SeO3 能强烈
13、的抑制抗原特异性 T 细胞增殖反应（图 2） 。但短时间处理 SAC 却提高了 SAC 的抗原递呈活性（表 1） 。如果进一步提高 SAC 的剂量，硒对抗原递呈细胞活性的促进效应便会减弱。如果硒处理 SAC 时间太久（如 3h） ，硒反而对 SAC 的抗原递呈功能呈抑制效应（表 2） 。因此，硒对抗原递呈细胞活性的促进作用取决于 Na2SeO3 的剂量及其作用于细胞的时间。表 2 硒处理时间长短对巨噬细胞抗原递呈功能的影响Table 2 Effect of time of selenium treatment on antigenPresentation by macrophagesStimu
14、lating cells Na2SeO3 treatment* TNP-coupled LNT proliferation (3H-TdR uptake,cpm)*- - - 57035SAC, 5104 - - 133121SAC, 5104 - + 188763627SAC, 5104 1h + 23000874SAC, 5104 2h + 28751711SAC, 5104 3h + 14809736* SAC were treated with selenium(1000ng/ml)for various lengths of time,washed three times with
15、PBS and then coupled with TNP;*4105 primed LNT were stimulated by SAC or SAC-TNP for three days and cell proliferative response was measured by 3H-TdR incorporation by LNT讨 论Spallholz 曾报道硒可提高豚鼠对致敏剂二硝基氯苯的敏感性，但未探索其作用机理 5。本组也得到相似的实验结果，硒处理能提高动物对致敏剂三硝基氯苯（TNCB）的敏感性，明显加强小鼠的迟发超敏反应（DTH） 。本研究检查 DTH 反应在体外的表现抗原
16、特异性 T 淋巴细胞增殖反应。结果证明，在剂量合适时，硒在体外能明显增强 T 淋巴细胞对抗原刺激产生的增殖反应。在该体外实验系统中，刺激细胞是结合了半抗原三硝基苯基（TNP）的正常小鼠脾脏粘附细胞（SAC） 。本组以前的实验结果证明，SAC 在反应中实际上起着递呈抗原的作用 10。国外有报道已证明，体内的 DTH 反应依赖于巨噬细胞递呈抗原。例如，经皮下给小鼠注射结合了 TNP 的巨噬细胞如 SAC，也能象 TNCB 那样使动物致敏，而非巨噬细胞不具备这种能力 11。巨噬细胞递呈抗原的功能在免疫反应的诱导阶段超着很重要的作用。许多研究表明，抗原直接刺激 T 细胞往往诱导抑制性 T 细胞产生，加
17、入巨噬细胞后，则能诱导产生辅助性T 细胞 12，13 。巨噬细胞递呈抗原功能受障碍时，机体的免疫功能低下 14。所以从某种角度来说，研究巨噬细胞的抗原递呈功能可以了解机体免疫功能状态。本结果表明，用硒处理小鼠后，硒在体内能增强 SAC 的抗原递呈活性，体外用适量的Na2SeO3 直接处理正常小鼠 SAC 一段时间后，SAC 的抗原递呈功能也得以增强。这说明，硒对迟发超敏反应的促进作用与硒增强象 SAC 这样的巨噬细胞的抗原递呈功能有关。硒很可能在体内促进皮肤内的巨噬细胞郎格罕氏细胞（Langerhans cells）的抗原递呈功能因而使 DTH 反应得以加强。当然，硒也可能通过其它途径来加强
18、DTH 反应。这还有待深入研究。硒对抗原递呈细胞功能的增强作用也可部分解释硒对体液免疫反应的增强作用，因为抗体产生的过程也依赖于巨噬细胞递呈抗原。目前尚不知道硒促进抗原递呈功能的作用机理。一条重要的线索是硒为体内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的辅因子。GSH-Px 的功能是在体内降解代谢过程中产生的过氧化物。有的过氧化物对细胞膜和溶酶体膜具有损伤作用，有的能进一步氧化成免疫抑制剂如前列腺素。硒很可能增强 GSH-Px 酶活性，来加速降解过氧化物 1，从而消除免疫抑制物的影响，保证巨噬细胞细胞膜和溶酶体膜的结构完整，这都有利于巨噬细胞对抗原的摄入、加工处理和再表达。关于这点也有待深入研究。参
19、考文献1.Griffin AC.Role of selenium in the chemoprevention of cancer.Adv Cancer Res 1979;29:4192.Wanger PD.Selenium interaction with carcinogens.Fundam Appl Toxicol 1983;3:4243.Marsh JA,et al .Influence of dietary selenium and vitamin E on the humoral immune response of chick(4105).Pros Soe Exp Biol Me
20、d 1981;166:2884.Spallholz JE,et al.Immunological response of mice fed diets supplemented with selenium.Proc Soc Exp Biol Med 1972;143:6855.Spallholz JE.Anti-inflan natory,immunologic and careinostatic attributes of selenium in experimental animals.J Adv Exp Med Biol 1981;145:436.张叔人，等。硒增强细胞免疫的研究硒对小鼠
21、 T 淋巴细胞功能的影响。中国免疫学杂志 1986；2：2577.张叔人，等。硒促进淋巴细胞产生 IL-2 但不影响其对 IL-2 的反应性。中国医学科学院学报 1988；10：2458.尹莉，等。巨噬细胞的细胞毒功能异质性及硒的影响。中国免疫学杂志 1987；3：1399.张叔人，等。硒对巨噬细胞功能的调变。中华微生物学和免疫学杂志 1988；8：7310.夏汉章，等。促癌剂十四酰佛波乙酸酯（PMA）对细胞免疫的影响，.PMA 抑制脾脏粘附细胞的抗原提呈功能。中国免疫学杂志 1986；2：19711.Green MI,et al.Mechanisms of regulation of ell
22、-mediated immune response.I.Effect of the route of immunization with TNP-coupled syngeneic calls on the induction and suppression of contact sensitivity to picryl chloride,J Immuol 1978;120:160412.Ishizaha K,et al.Generation of specific helper cells and suppressor cells in vitro for the IgE and IgG
23、antibody response,J Immunol 1976;117:4013.Pierres M,et al ,Antigen specific T cell mediated suppression.IV.Role of macrophages in the generation of L-glutamic acid60-L-alanine30-L-tyrosine10(GAT)-specific suppressor T cells in response.J Immunol 1978;121:130714.Green MI.et al.Impairment of antigen-presenting function by ultraviolet radiation Proc Natl Acad Sci USA 1979;76:6591
