1、大学生科技创新基金项目1纤维堆囊菌 So9733-1 热休克蛋白 HSP60 基因的克隆与分析吴凡 刘鑫 吴志红摘 要：【 目的】克隆获得纤维堆囊菌 So9733-1 热休克蛋白的完整基因，并对其进行序列分析。 【方法】 根 据 HSP60 保守区设 计 合 适 的 PCR 引 物 ， 以 So9733-1 基因组 DNA 为模板， 通 过 PCR 扩 增 、 片 段 克 隆 和 测 序 分 析 ， 筛 选 获 得 HSP60相关的基因片断。以该片断序列为基础，通过 Tail-PCR 扩增获得该片断两侧的未知基因序列，最终获得 So9733-1 热休克蛋白 HSP60 的完整基因。 【结果】利
2、用 H279 和H280 高兼并度引物，首先成功地在纤维堆囊菌 So9733-1 获得 HSP60 相关的基因片段。以该片段序列为基础，利用 Tail-PCR 方法成功地获得了该序列上游的未知基因序列。通过 Tail-PCR 方法克隆该片段下游的未知基因序列的相关工作正在进行中，期望在近期完成相应的工作。纤维堆囊菌 So9733-1 热休克蛋白 HSP60 完整基因序列克隆及其序列特征的解析将为后续研究和应用奠定良好的基础。关键词：纤维堆囊菌 ；热休克蛋白 HSP60 ；Tail-PCR ；基因克隆 ；序列分析大学生科技创新基金项目2Cloning and Analysis of Heat-S
3、hock Protein from Sorangium cellulosum So9733-1WU Fan, LIU Xin， WU Zhi-HongAbstract: 【 Aim】 To obtain the full length gene of 60kDa heat-shock protein (HSP60) from Sorangium cellulosum So9733-1 and analysis its characters. 【Methods】Using the primers developed complementary to the conserved regions o
4、f HSP60 or the primers selected from references,PCR amplification of the DNA fragment related to HSP60 gene was carried out with the genomic DNA from So9733-1 as a template. The flanking sequences upstream and downstream the obtained HSP60 related DNA fragment was further gained by Tail-PCR. The ful
5、l length HSP60 gene from S. cellulosum So9733-1 was expected. 【Results】 A pair of high degeneracy primer was applied in the PCR anplification of HSP60 gene fragment and successfully resulted in a HSP60 gene related DNA fragment in S. cellulosum So9733-1.Based on the cloned DNA sequence, 2 sets of sp
6、ecific primers for the upstream and downstream flankings in the Tail-PCR were developed, respectively. The upstream of the cloned DNA fragment was obtained with the combination of the specific primers and the AD primers using Tail-PCR. The further amplification and cloning of the downstream of the c
7、loned DNA fragment by Tail-PCR was in progress. The cloning and analysis of full length HSP60 gene were expected in the near future. The results would supply a wise step for the consequent research. Key words: Sorangium cellulosum; heat-shock protein; Tail-PCR; gene cloning; Sequences analysis大学生科技创
8、新基金项目3引 言粘细菌是一类具有复杂多细胞行为特征的原核生物类群。其多细胞行为特征，不但是原核生物细胞分化发育和信号传导调控研究的重要模式材料，也是粘细菌分类的重要依据1,2。粘细菌的分类基础主要是形态特征，如营养细胞和粘孢子的形状、菌落形态，尤其是子实体的形状和结构。一些形态学特征基本稳定可靠，而有些则并不稳定，在实验室的菌株分离、纯化和传代培养中易于退化或丢失3。应用于属和种分类水平上的特征性子实体的形态和结构就属于后者。这些不稳定性或不明显的特征使得粘细菌的分类鉴定，尤其在种和菌株这一分类单元上的分类鉴定非常困难。目前，粘细菌大约有50个种具有稳定的形态特征，分属于3个亚目，5个科，1
9、7个属中4。由于缺乏更多的有力证据，目前普遍接受的分类结果实际上仍然是以人为的选择方式决定着如何进行分类，带有更多的主观因素。因此目前的分类结果仍存在着不同的重排和分组的多种可能性，其中对于种的区分仍然是遇到的主要问题，尤其是以下各属中种的区分： corallococcus, Archangium, Cystobacter, Nannocystis, Sorangium和 Polyangium.5。因此，以新的分类方法获得更多的信息以用于鉴别工作中是十分必要的。建立一种可以客观反映粘细菌遗传进化和种系发生的分类鉴定系统，不依赖于长周期的分离纯化过程，并避免对不稳定的菌落和形态特征的依赖，必然加
10、深人们对粘细菌分类的认识。现代分子生物学研究的结果显示，在DNA分子水平上进行的分类与鉴定，使细菌的分类越来越趋向于自然的遗传进化，更科学和精确6。因此将形态学特征和一定的生化特征分类方法与分子分类与鉴别方法相结合和比较，必将进一步完善粘细菌的分类体系。堆囊菌属（ Sorangium）是粘细菌中可以降解纤维素的生理类群，长期以来一直是一个单种属，即该属只含有一个种 Sorangium cellulosum。最近出版的原核生物（The prokaryotes III）中再次指出该属多种多样的 分离物应当进一步地进行划分，并建议以子实体的颜色为划分依据而分为3个种：Sorangium compos
11、itum 产生桔黄色的子实体, So. cellulosum 产生棕或者灰色的子实体， So. Nigrum则产生黑色的子实体5。但正如作者自己所指出的一样，子实体颜色这一特性似乎并不足以作为这些种的可靠分类依据。本实验室对降解纤维素粘细菌堆囊菌属（ Sorangium） ，进行大学生科技创新基金项目4的16S rRNA基因序列研究结果显示，与16S rRNA基因序列具有良好对应性的是粘孢子的大小和孢子囊的形状，而不是子实体的颜色和菌落形状7。该结果从一个方面证实子实体颜色这一特性不足以作为菌株进行种的归属分类的的可靠依据。因此，堆囊菌属（ Sorangium）中各菌株的种的分类归属标准和结果
12、仍是一个悬而未决的问题，有待进一步的探索。本实验室的前期工作中，尝试利用 16S rRNA 基因序列进行的鉴定结果表明，16S rRNA 基因序列更适合于在科和亚目的水平上的鉴定，而在近缘属，尤其是种水平上缺乏鉴别力2，7 。因此寻求新的分类靶点势在必行。根据文献报道，生物细胞中普遍存在的，但处于不同进化保守水平的热休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）在种和菌株这一低级分类单元水平上具有明显的分辨鉴定作用，其中蛋白分子量为 60kDa的热休克蛋白 HSP60 得到了广泛的研究和应用8 ， 9，并积累的大量地序列信息（http:/cpndb.cbr.nrc.ca） 。本试验室
13、尝试着将这一分析靶标应用于堆囊菌属的分类分析中，但缺乏相关的序列信息。因此，本研究拟以纤维堆囊菌 So9733-1 为研究对象，提取其基因 DNA 作为模板；设计、收集和筛选扩增热休克蛋白 HSP60 的 PCR 引物，扩增获得 HSP60 相关的基因片段；以该片段为基础，利用 Tail-PCR 的方法，克隆获得其热休克蛋白 HSP60 的完整基因并进行相关的生物信息学分析，解析其序列特征。该工作的结果将会为该基因应用于堆囊菌属多样化菌株的鉴别鉴定以及种的划分等工作提供参考和基础。1材料和方法1.1 材料1. 1. 1 菌株和质粒纤维堆囊菌 So9733-1 为本实验室分离所得。载体质粒为 p
14、GEM-T easy，购自Promega 公司。1. 1. 2 工具酶和化学试剂本实验所用的工具酶均购自大连宝生物公司。提取质粒所用试剂盒为 HQ CoCl2 20mg; CuSO4 10mg; Na2MoO4.2H2O 10mg; ZnCl2 20mg;LiCl 5mg; SnCl2.2H2O 5mg; H3BO3 10mg; KBr 20mg; KI 20mg; EDTA,Na-Fe+3 salt(trihydrate) 8g将纤维堆囊菌 So9733-1 接入 CNST 固体斜面上，30恒温箱中培养至 10 天左右，然后将培养物转接到 M26 液体培养基中，30，200rpm 摇床培养两
15、周左右，离心收集菌体，STE 缓冲液洗涤 2 次，冷冻保藏。1. 2. 2 纤维堆囊菌 So9733-1 基因组 DNA 的提取以上述收集的菌体为材料，以 CTAB 方法提取基因组 DNA10，将提取得到的 DNA经 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。合格的 DNA 用作 PCR 反应中的模板。1. 2. 3 PCR扩增So9733-1 HSP60基因片段经比较分析，从文献中9选 择 下 列 一 对 高 兼 并 性 引 物 用 于 扩 增 So9733-1 大学生科技创新基金项目6HSP60 基因片段：H279：5-GAATTCGAIIIIGCIGGIGA(TC)GGIACIACIAC-3 H280
16、：5-CGCGGGATCC(TC)(TG)I(TC)(TG)ITCICC(AG)AAICCIGGIGC(TC)TT-3PCR 反应体系：25l 反应体系中，模板约为 300ng, 每一种 dNTP 的浓度为 2.5nmol， Taq DNA 聚合酶为 1.5 单位，2.5l 的 10 PCR 反应缓冲液，每一引物的浓度均为 50pmole。PCR 反应程序：96.0 ，3 min； 94.0，1 min； 47.0 ，1 min；72.0，2 min；30 个循环；72.0，10 min.取 5.0l PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。1. 2. 4 Tail-PCR引物根据从 So9733
17、-1 获得的 HSP60 基因片断，设计了一组（3 个）嵌套式特异性Tail-PCR 引物（见表一） ，用于扩增已知基因片段上游的未知序列。表一 上游嵌套式特异性 Tail-PCR 引物引物名称 序 列 Tm（）RSP1 5-TCG ATG CCG CGC TT(G/C) AGG TC-3 61.9RSP2 5-CCT CCT TGC C(G/C)A CCT TCT CC-3 61.9RSP3 5-CCG CGG TCG AAC TGC ATG CC-3 66.0注：引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成根据从 So9733-1 获得的 HSP60 基因片断，设计了另一组（ 3 个）嵌套式
18、特异性Tail-PCR 引物（见表二） ，用于扩增已知基因片段下游的未知序列。表二 下游嵌套式特异性 Tail-PCR 引物引物名称 序 列 Tm（）FSP1 5- ggAC CTS AAg CgC ggC ATC gAC -3 74FSP2 5-ggA gAA ggT Sgg CAA ggA ggg C-3 74大学生科技创新基金项目7FSP3 5- CAT gCA gTT CgA CCg Cgg CTA C-3 72注：引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成Tail-PCR 试验中与特异性引物配合使用的随机兼并引物以及其序列信息见表三。表三 Tail-PCR 所使用的随机兼并引物引物名
19、称 长度（bp） 序 列 Tm ()AD1AD2AD3AD4AD5AD6AD816161616161616NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAAGTNCGA(G/C)(A/T)CANA(A/T)GTT(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGATG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGANCAGCT(A/T)(G/C)CTNT(G/C)CTTAG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGGTC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA43.943.943.943.943.946.4注：引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成1. 2. 5 Tail
20、L-PCR 扩增 So9733-1 HSP60 基因片断的上游序列用表一中三个嵌套的特异性引物与随机兼并引物（AD 引物，见表三）配对，Tail-PCR 扩增 HSP60 基因片断的上游序列。第一轮 PCR（1）在 0.2ml 的 EP 管中建立如下反应体系：0.1l 62.5mol/L 的 RSP1 引物，2l 62.5mol/L 的 AD 引物， 2l 2.5mM 的 dNTP，1l 的 So9733-1 基因组 DNA 作模板（约 300ng） ，0.2l 的 Ex Taq （1u） ，10l 的 2*GC buffer，最后补无菌去离子水至每管 20l。（2）PCR 反应程序：96 2
21、min;96 30s；63 1min；72 大学生科技创新基金项目82min；5cycles96 30s;30 3min;以 0.3/s 的速度升至,72 ，保持 2min 96 30s; 44 1min; 72 2min;10cycles96 30s; 63 1min; 72 2min; 96 30s; 63 1min; 72 2min;96 30s; 44 1min; 72 2min;3 个程序为一组循环 12 次，共 36 个反应第二轮 PCR（1） 在 0.2ml 的 EP 管中建立如下反应体系：0.2l 62.5mol/L 的 RSP2 引物，2l 62.5mol/L 的 AD 引物
22、， 2l 2.5mM 的 dNTP，取第一轮 PCR 反应产物的 100 倍稀释物 2l 作为本轮 PCR 反应的模板，0.2l 的 Ex Taq（1u） ，10l 的 2*GC buffer，最后补无菌去离子水至每管 20l。（2）PCR 反应程序：96 2min; 96 30s; 63 1min; 72 2min96 30s; 63 1min; 72 2min96 30s; 44 1min; 72 2min3 个程序为一组循环 12 次，共 36 个反应72 10min大学生科技创新基金项目9第三轮 PCR（1）在 0.2ml 的 EP 管中建立如下反应体系：0.2l 62.5mol/L
23、的 RSP3 引物，2l 62.5mol/L 的 AD 引物， 2l 2.5mM 的 dNTP，取第二轮 PCR 反应产物的 100 倍稀释物 2l 作为本轮 PCR 反应的模板，0.2l 的 Ex Taq，10l 的 2*GC buffer，最后补无菌去离子水至每管 20l。（2）PCR 反应程序：96 2min;96 30s; 63 1min; 72 2min96 30s; 63 1min; 72 2min96 30s; 44 1min; 72 2min3 个程序为一组循环 5 次，共 15 个反应。96 30s; 44 1min; 72 2min20cycles72 30min三轮 PC
24、R 反应结束后，各取 5l 进行琼脂糖凝胶电泳检测。1 2. 6 PCR产物的克隆、测序及序列分析第三轮PCR产物切胶回收，与pGEM-T easy 载体按常规方法连接并转化宿主菌 E. coli DH5，通过LB+ X-gal平板上的蓝白斑筛选重组克隆子，并通过限制性内切酶酶切图谱分析鉴别重组质粒。选取合适的克隆子送上海博亚生物有限公司测序，对序列进行分析。2、结果与讨论2. 1 纤维堆囊菌So9733-1基因组DNA的提取：以CTAB法提取纤维堆囊菌So9733-1基因组DNA电泳结果见图1。大学生科技创新基金项目10图1：提取基因组DNA电泳图M:/ HindIII， 1-3: 染色体D
25、NA图1结果显示，提取的基因组DNA片段主要集中在大于23Kb的位置上，能够满足后续PCR试验的需要。2. 2 纤维堆囊菌So9733-1 HSP60基因片段的扩增以纤维堆囊菌 So9733-1 基因组 DNA 为模板，引物 H279 和 H280 扩增 HSP60 基因片段，PCR 产物电泳结果见图 2。获得了大约 600bp 的扩增片段。图2：PCR 扩增So9733-1 HSP60 基因片段的电泳图谱M:DL-2000， 5: 阳性扩增结果2. 3 So9733-1 HSP60基因片段的克隆与重组子的验证：PCR获得的So9733-1 HSP60基因片段克隆后，重组转化子经 EcoRI酶切，电泳检测结果见图3。结果表明，重组质粒中已插入与PCR产物大小相同的外源片段。
