1、苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 1 页 共 5 页温度对高效液相色谱分离性能的影响对于高效液相色谱而言，温度是一个一直被忽视而又非常重要的因素。升高色谱分析的柱温，不仅可以加快分析速度，而且还可以提高分离效率、改善峰形、调节选择性、降低有机溶剂的使用，是一个非常有效而又十分经济适用的方法，与其它调节分离效果的方法相比，具有其独特的优势。本文综述了温度对高效液相色谱分离特征的影响，介绍了温度作为一便捷的调节参数在高效液相色谱中的应用前景。Influence of Temperature on Separation Behaves of HPLCCheng H
2、ongda, Li Tong, Zhang Weibing1.Qiqihr University, qiqihaer,1160112.dalian institute of physical chemistry,dalian ,1610063.Dalian Elite Analytical Instruments Co. Ltd., Dalian 116011Abstract: Temperature is an important factor of HPLC performance. Because of the elevated temperature, viscosity of the
3、 mobile phase decrease, backpressure over the column reduced, the speed of mobile phase can be improved, and shorten the analytical time and adjust the selectivity. At the same time, under the higher temperature, the use of organic solvent can be decreased. Elevated the analytical temperature is an
4、efficient and economic method for high performance chromatography. The influence of temperature on on Separation Behaves of HPLC is reviewed in this paper.Key words: high temperature; high performance liquid chromatography; review1引言对样品进行高效、高灵敏度的分离分析，是每个色谱工作者所追求的目标。对于高效液相色谱分离条件的选择，人们一般将注意力投向调节溶剂的组成、
5、溶剂的 pH 值、固定相的种类及填充颗粒的尺寸和柱子的尺寸等，而温度作为影响色谱分离的重要因素却一直被人们所忽视。提高色谱分离温度可以提高分离效率的原理在高效液相色谱的发展初期就已经提出1-2，但是，由于升温带来的柱子稳定性差、寿命低等难题，使得对通过调节温度来优化色谱分离的研究一直没有取得很大进展。直到 1980 年代后期，高温液相色谱技术才逐渐得到许多研究者的重视3。1987 年，Warren2研究了温度对柱效的影响；之后，Horvath4等通过对 HPLC 分离过程中溶质输运特征的理论分析，证实升高柱温是改善分离性能的有效途径。使用反相色谱，Alain 5等考察了温度对同系物分离的影响
6、。Lacasse6等在 125采用反相柱分离了脂肪酸苯甲酰甲酯，也在 145用硅胶柱分离了非离子表面活性剂。近年来,随着新型热稳定性强的固定相的出现7-9,高温液相色谱技术得到了快速的发展，氧化锆基质固定相的应用使得将高温液相色谱变成一种高速、高效的分析方法成为可能7。由于水在高温下的极性、粘度等物理性质产生较大的变化，以亚临界水为流动相的高效液相色谱法越来越受到关注10-11，张维冰12等讨论了以亚临界水为流动相的高效液相色谱方法的进展，并对其仪器系统进行了总结。李玲13等对 SubWC(亚临界水高效液相色苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 2 页 共 5
7、页谱)在填充柱和毛细管柱上分离中高极性化合物的色谱规律进行了研究。为克服影响柱效的冷点效应,Liu14等设计了专门的适合高温的色谱仪和检测器。Thompson15等就分析样品的热稳定性问题进行了讨论，并且提出了一个分析物热稳定性的标准。本文通过对温度与高效液相色谱分离特性关系的讨论，综述升高柱温在 HPLC 方法发展方面的应用。2、温度对柱效的影响分离效率低、分析时间长是限制液相色谱发展的一个重要因素，气相色谱可以达到 500-1000 理论塔板/s 的分析速度，而液相色谱的有效分离能力只有 20-40 理论塔板/s，完成一次分析往往需要几十分钟的时间。增加流动相的速度可以加快分析，但是也可能
8、导致柱效的降低。由 van Deemter 方程描述的板高与流动相线速度的关系H = A + B/u + Cu （1）其中 u 为流动相线速度；A 为径向扩散系数；B 为纵向扩散系数；C 为传质阻力系数。A 与色谱柱的填充质量有关，其受温度的影响不很明确，但至少有一点肯定，温度升高使流动相扩散增强，加快了流动相的层流和分析物分子的混合16。 B2Dm， 是常数，决定于色谱柱填充质量，Dm 是溶质在流动相中的扩散系数，由于溶质的扩散能力随温度的升高而增大，因此 B 与温度成正比。C 包含溶质在两相之间的传质阻力和在固定相中的传质阻力，二者均与溶质的扩散能力有关，由于溶质的扩散速率的加快， C 与
9、温度成反比17。根据式（1），Yang18探讨了温度对板高的影响，并且建立了一个温度与板高的数学关系式H = a + b(T2 273T ) + c/T （ 2）式中 T 为温度；a、b、c 在一定线速度下为常数。a 为涡流扩散系数；b(T 2 273T )为径向扩散系数；c/T为传质系数。当线速度一定时，在低温状态下，b(T2 273T)c/T ，升温导致板高增加；在高温状态下，b(T2 273T)c/T，升温使板高降低，显然，在升温过程中可以得到板高的一个最小值，可取得最高的柱效。刘光会3等通过理论计算得出不同温度下 H-u 关系曲线，结果如图 1 所示。由图 1 可以看出，温度对 H u
10、关系的影响包括使曲线的最低点右移及右侧的曲线斜率降低2，其结果为温度升高后流速对柱效的影响大大降低，流速可以达到很高而柱效不会降低太多。因此，高温条件下有利于建立快速分析的方法。苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 3 页 共 5 页图 1 H-u 关系曲线色谱柱:0.85m 0.075mm; I.D. 空石英管;移动相:甲醇;样品:苯乙酮 Li19等在聚丁二烯修饰的氧化锆（PBD-Zriconia）色谱柱上快速分离多环芳烃，检测，洗脱剂为 50%乙腈，色谱柱尺寸为 100mm4.6mm i.d。在 30时，流速为 1mL/min，100时流速为 5 mL/mi
11、n。随着温度的升高和流速的增大，柱效增加，分析时间由30时的 70 min 减少为 100时的 4 min。虽然分析时间大大减少，分离效果却非常好，峰形更窄且对称，充分说明了温度对柱效调节的有效性。3、温度对保留时间的影响温度对保留的影响可用范特霍夫方程来表示lnk=-H/RT+S/R+ln （3）H 为溶质在两相之间传递的焓变,S 为相应的熵，R 是摩尔气体常数, T 是溶质温度, 是相比。由于 H 一般为负值，因此 lnk 与 T 成反比，随着温度升高，溶质的容量因子减小，减小的程度与溶质的焓变有关，焓变越大，温度对保留的影响越大。Greibrokk20在 20-70范围内分离了三种维生素
12、，考察了温度与容量因子的关系。Jones21等研究了极性和非极性溶质在以亚临界水为流动相的反相色谱中的保留行为，发现随着柱温的升高，极性和非极性溶质的容量因子都减小，4-氯酚的保留时间在 100时为 19 min，150时减少为 6.4 min，甲苯的容量因子在 100时为 27，而当温度升高到 200后减小到 4.84。Yan 22等以乙腈-水为流动相，考察了温度由 25升高到 150时五种酮类保留时间的变化，结果在图 2 中给出。在 25，最后洗脱出来的苯十四酮的洗脱时间为20min，而当温度升高到 150后，苯十四酮的洗脱时间变为 20s，保留时间大大缩短。苏州市莱顿科学仪器有限公司
13、 TEL：0512-66325740第 4 页 共 5 页图 2 五种酮保留时间的变化峰：1 苯乙酮 ；2 苯辛酮 ；3 苯十酮 ；4 苯十二酮 ；5 苯十四酮A: 25 流动相 30%ACN 流速 4 ml/minB: 150 流动相 30%ACN 流速 15 ml/min4、温度对分离选择性的影响及对峰形的调节作用8BzJ6U3b46 相比温度对柱效与保留时间的影响，温度对分离选择性的影响要复杂的多。当溶质的 H 与 k成非线性关系时，改变温度可以有效改善分离的选择性。对于含有两个或两个以上独立保留机理的样品如胺在硅胶柱上的分离，升高温度将会使分离得到改善。而对于分子量小、保留机理单一的溶
14、质，其选择性将会随温度的升高而降低23。Li24考察了温度对只靠疏水作用进行保留的样品分离的影响加以研究。分离氨基酸时发现，当缓冲试剂的 pKa 小于溶剂的 pKa 时，升高温度分离较理想，而当的缓冲试剂的 pKa 大于溶剂时，分离度就会降低。Hancock25等通过改变温度和溶剂组成，在 C8 和 C18 柱上研究了缩胺酸和蛋白质的选择性问题，他们发现增加柱温可以很好地提高分离的选择性。Peter26采用聚丁二烯涂敷的二氧化锆研究了高温对反相液相色谱选择性的影响。他们认为，分离选择性很大程度上依赖于溶质的类型，对于具有相似结构的溶质，温度对选择性几乎没有影响，而对于具有不同功能基团的溶质。G
15、reibrokk 20认为温度是反相色谱中一个控制选择性的重要变量，即使选择性随着温度升高会有所下降，也并不意味着分离效果不好，因为在高温下，色谱峰的拖尾现象将会有所改善，峰形也会变得更加对称。Kondo27等在 C18 柱和聚合物柱上对儿茶酚、苯胺和嘧啶的分析，无论是以纯水作为流动相，还是以水和有机溶剂共同作为流动相，色谱峰的对称性都随温度的升高而提高。5、高温下流动相的洗脱特征在色谱分析中,流动相的选择至关重要,它直接关系到能否将溶质分离或分离的效果。HPLC 分析中常采用水与甲醇、乙腈等有机溶液作为流动相，以一定的配比或者以逐步改变比例的梯度洗脱方式进行色谱分离。在高温色谱中，由于温度的
16、升高，流动相有了更大的选择。Peter26 等以乙腈与水为流动相，在温度梯度下分离烷基苯混合物。随着温度的不断升高，分析时间由 35min 降低到 13min,并且峰变高，信噪比得到改善。Snyder28 等考察了温度梯度与洗脱梯度对离子化合物选择性的影响，表明二者均对选择性有很大影响，并且它们所起的作用相对独立，因此可以把温度调节和洗脱比例调节相结合来进行分析。Marsin29 在高温状态下分离了四种三唑杀真菌剂，色谱柱：3mPBD- Zirconia，100 m m2.1mm i.d.,洗脱剂为乙腈-水。结果显示，温度从 100升高到 150，四种三唑杀真菌剂的容量因子减小，温度升高 4与
17、乙腈浓度升高 1%效果相当；此外，高温下检测器的检测限也有所降低，在 140以纯水作为洗脱剂时，最低检测限达到 50pg，远远低于传统的高效液相色谱。与容量因子的减小相比，柱效却有所降低，Carr30将这一结果归因于加热管的内径太大及纵向的分子扩散。Greibrokk 20等也得出了类似的结论，温度每升高 45、3与乙腈、甲醇的浓度增加 1有相同的效果，调节温度在 1090范围内变化相当于调节 pH 值从 2 到 7。3V6E2WZI/ -qx)w46 一般来讲，水的极性较大，对弱极性和非极性溶质的洗脱效果相对较差，需和甲醇或乙腈等有机溶剂配合使用，但是随着温度升高，水的粘度、介电常数会减小，
18、极性也会降低，调节温度可以改变苏州市莱顿科学仪器有限公司 TEL：0512-66325740第 5 页 共 5 页水的极性，使其与甲醇和乙腈极性相当，可以通过升温来使水达到与有机溶剂配比的洗脱效果。近年来，出现了许多对以亚临界水为流动相的高温液相色谱的研究10,11,31-33。高温液相色谱中，也可以单独用水作为洗脱剂。这样不仅可以避免有毒溶剂对人体的危害，还可以节省大量的有机溶剂，更为重要的是，由于水在火焰离子化检测器上没有吸收，可以将 FID 这种高高灵敏性检测器用于高效液相色谱34-36，大大拓宽了液相色谱的使用范围。6、程序升温将程序升温运用到高效液相色谱中在 20 年前便已出现，
19、只是由于缺乏合适的仪器和稳定的色谱柱，这一技术没有得到很好发展。与溶剂梯度相比较，程序升温具有许多优点。Andersen37认为，相比溶剂梯度，程序升温对同系物以及分子量大的溶质的分析具有更大的优势。在与检测器的连接上，程序升温与溶剂梯度相比也有很大优势38,39。阻碍程序升温技术发展的首要问题是峰展宽，色谱柱的温度随时间变化，其对温度的反应快慢即其温度平衡时间的长短将直接影响分析结果，柱温如果不能及时达到所设定的温度便会产生峰形展宽。如图 3 所示，色谱柱与进入柱子的流动相存在温差，如果进入色谱柱的流动相温度低于色谱柱，当流动相进入色谱柱后，便会产生一个温度梯度，即柱壁附近流动相的流速小于柱
20、中央流动相的流速，表现为色谱带展宽。对流动相进行预热是克服由温差带来谱带展宽的有效方法。色谱柱直径越小，其对温度的反应越快，达到设定温度的时间就越短，就越不容易产生峰展宽。因此，小内径的柱子更适合于在程序升温中应用。Carr40推荐在程序升温中使用 2mm 内径的柱子，以取得好的分析结果。A 流动相预热 B 流动相未预热图 3 温差对峰形的影响417、展望随着生产的发展和科学技术的进步，人们对分析测试技术提出了更高的要求，对于液相色谱分析，不仅需要有好的准确性，也要求有更高的分离效率，特别是当测试对象数目巨大时，分析效率便显得尤为重要。高温液相色谱是色谱分析的一个新的发展领域，它既具有液相色谱的高选择性，又具有气相色谱的高分离效率。通过升高温度，分析时间成倍缩短，与此同时仍然保持了非常好的分析效果。高温液相色谱目前正处于快速发展的阶段，尽管还存在一些问题有待解决，但可以相信，随着仪器和分析方法的不断完善，其必将在环境科学、医药学及生命科学等领域发挥重要的作用。
