1、作者简介：邱少华，男，副主任药师，研究方向药物分析，Tel:0539-6379010, E-mail:相对校正因子法测定缬沙坦中缬沙坦苄酯的含量邱少华（临沂市食品药品检验检测中心，临沂 276000）摘要:目的： 建立测定缬沙坦原料药及制剂中缬沙坦苄酯的含量测定含量的方法。方法： 采用反相高效液相色谱加校正因子的主成分自身对照法。；色谱柱为 C18 柱，流动相为水-乙腈（11）( 用冰醋酸调节 pH 值至 2.5），检测波长 245 nm，流速量为 1.0 mLmin-1。 ； 测定缬沙坦和缬沙坦苄酯的标准曲线方程，以斜率计算缬沙坦苄酯相对缬沙坦的校正因子，用相对保留时间对缬沙坦苄酯进行定位。
2、结果： 缬沙坦苄酯的相对保留时间为 5.4，相对校正因子为 0.88。并；对 13 批次样品中缬沙坦苄酯的含量进行测定，测得结果与对照品法测定结果一致。结论： 该方法专属性强，、灵敏度高，可准确有效地测定缬沙坦中缬沙坦苄酯的含量。关键词：缬沙坦；缬沙坦苄酯；相对校正因子；含量测定Determination of Valsartan Benzyl Ester in Valsartan by Relative Correction Factor MethodQiu Shao-hua （Linyi Institute for Food and Drug Control Inspection Cent
3、er of Linyi , Linyi 276000）AbstractBSTRACT: ObjectiveBJECTIVE: To establish a method for the determination of vValsartan bBenzyl eEster in vValsartan raw materials and tablets. MethodsETHODS: HPLC and mMain component self-comparison with correction factor method were adopted. The determination was p
4、erformed on a C18 column with water and acetonitrile (1:1)( adjusted to pH to 2.5 with acetic acid) as the mobile phase, the flolw rate was 1.0 mLmin-1 and the detection wavelength was 245nm. The linear equations of vValsartan and vValsartan bBenzyl eEster were determined, slopes were as used to cal
5、culate the relative correction factor of vValsartan bBenzyl eEster to Valsartan and relative retention time was used to determine the position. ResultsESULTS: The relative retention time of vValsartan bBenzyl Eester was 5.4, and the relative correction factor was 0.88. and 13 batches of samples were
6、 determined by relative correction factor method (RCFM) and standard curve method (SCM) ,. there wereas no differences in the results between the two methods. ConclusionONCLUSION: The method is specific and sensitive, it can be used for the quantitative analysis of vValsartan bBenzyl eEster in vVals
7、artan tablets and raw materials., and the relative correction factor method can reflect the content of valsartan benzyl ester more accurately. KeyEY WwordsORDS: vValsartan; vValsartan bBenzyl eEster; relative correction factor; content determination缬沙坦（Vvalsartan）化学名为 N-戊酰基- N-2-（1H- 四氮唑-5-基） 1,1-联苯
8、 -4-基甲基-L-缬氨酸 。，是一种高选择性型血管紧张素受体拮抗剂，具有良好的抗高血压作用，适用于各种类型轻、中度高血压，尤其对血管紧张素转换酶抑制剂不能耐受的患者，且无致咳的不良反应。缬沙坦原料药及制剂标准收载于中国药典(ChP) 20105 年版 1中，在美国药典 （USP36） 2、欧洲药典(EP) 38.0、英国药典（BP） 42013 和日本药局方（JP）16 2-5均有收载。缬沙坦在合成过程中产生的缬沙坦苄酯杂质，在 USP 36 中采用对照品法进行测定，在 EP 8.0、BP 2013 和JP16 中均采用主成分自身对照法进行检查。缬沙坦苄酯杂质对照品，国内没有供应，国外对照品
9、购买周期长、价格昂贵，不易获得。缬沙坦苄酯与缬沙坦（结构式见图 1）紫外响应因子不同，采用不加校正因子的主成分自身对照法，定量结果不准确。为此，本文拟建立了相对校正因子法进行测定，该方法不需要缬沙坦苄酯杂质对照品，定量结果准确可靠。图 1 缬沙坦（A）与缬沙坦苄酯（B）的结构式Fig 1 Structure of valsartan and valsartan benzyl esterA.缬沙坦（valsartan） B.缬沙坦苄酯（valsartan benzyl ester）1 仪器与试药Agilent 1200 高效液相色谱仪（配有自动进样器、 DAD 检测器、1200 化学工作站）；，
10、Mettler XS 205 电子分析天平。，CAPCELL PAK C18（4.6 mm150 mm，5 m），Sun Fire C18（4.6 mm150 ONOOHCH3HN NNNAONOOCH3HN NNNBmm，5 m），ZORBAX SB- C 18（4.6 mm 150 mm，5 m ），缬沙坦对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100651-201203，含量：99.8%，来源：中国食品药品检定研究院）；缬沙坦苄酯对照品（USP 对照品，批号：JOM318，含量：98%）；。缬沙坦原料药（A 企业提供，批号：0301309003 ），缬沙坦原料药（；B 企业提供，批号：13
11、02065A1），结沙坦原料药（；C 企业提供，批号：20130649）；，缬沙坦片及缬沙坦分散片（10 批次，来自 5 家生产企业）；。乙腈及甲醇均为色谱纯，冰醋酸为优级纯，高纯水，其他试剂均为分析纯，高纯水。2 方法与结果2.1 色谱条件及系统适用性试验流动相：水-乙腈（11）用冰醋酸调节 pH 值至 2.5，色谱柱为CAPCELL PAK C18（4.6 mm 150 mm，5 m），流动相为水-乙腈（11）（用冰醋酸调节 pH 值至 2.5），流量 1.0 mLmin-1，检测波长 245 nm，进样量：10 L，流速：1.0 mL min-1。分别取混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶
12、剂，依法在上述色谱条件下注入液相色谱仪，记录色谱图。结果主成分峰与各杂质峰之间分离度良好（见图 2），理论板数按缬沙坦峰计算不低于4000。2.2 溶液制备 2.2.1 供试品溶液 取本供试品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成每 1.0 mL 中约含缬沙坦 坦 1 mg 的溶液，作为供试品溶液。2.2.2 对照溶液 精密量取供试品溶液，用流动相稀释成每 1.0 mL中约含缬沙坦 1gml-1 的溶液，作为对照溶液。2.2.3 对照品溶液 精密称取缬沙坦对照品约 10 mg，精密称定，置 100 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为缬沙坦对照品储备溶液。精密称取缬沙坦苄酯对照品约
13、 10 mg，精密称定，置 100 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品储备溶液。分别精密量取上述 2 种对照品溶液各 1 mL，置同一100 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。注：以下顺序有调整，请按序号排版！2.5 3 方法学线性关系考察2.3.1 标准曲线的制备 分别精密量吸取混合对照品溶液1、2、5、10、20 L，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标 （Y ），进样量（X）为横坐标（X），进行线性回归，缬沙坦及缬沙坦苄酯其线性方程见表 1 分别为 Y=3.011 4X-0.065 9（r=1.000）、Y=
14、2.638 9X+0.143 6（r=0.999 9），进样量分别在 1.121.9ng 和 1.0220.50 ng 范围内与峰面积呈良好线性关系。表 1 缬沙坦及缬沙坦苄酯的线性方程及校正因子Tab1 Regression equation and correction factor of valsartan and Comment z1: 请给出称样量valsartan benzyl ester化合物(compound)线性方程(regression equation)相关系数(correlation coefficient)线性范围(linear range)/ng校准方程(calib
15、rated equation)校正因子(correction factor)LOQ/ng LOD/ng缬沙坦(valsartan)Y=3.0114X-0.0659 1.000 1.09721.94Y=3.0067X（1.000） 1.00 1.646 0.5485缬沙坦苄酯 (valsartan benzyl ester)Y=2.6389X+0.1436 0.9999 1.02520.50Y=2.6497X（1.000） 0.88 3.075 1.0252.9 3.2 加样回收率试验取 9份已知缬沙坦苄酯含量同一批号的样供试品粉末适量，精密称定，每份分别精密加入相当于样品中缬沙坦苄酯含量的50
16、%、 100%、150% 的缬沙坦苄酯对照品，按“2.2.1”项下方法制备高、中、低 3种浓度的供试品溶液，依法进样测定。计算缬沙坦苄酯的平均回收率，结果见表 1。表 12 缬沙坦苄酯加样回收率试验结果Tab 2 Results of recovery test for valsartan benzyl ester成分(component)样品量(sample amount) /g加入量(added amount) /g测得量(amount found)/g回收率(recovery)/%平均回收率(average recovery)/%RSD/%100.1 51.25 151.5 100.29
17、100.1 51.25 151.9 101.07100.5 51.25 151.1 98.73100.2 102.5 202.1 99.41100.7 102.5 202.4 99.22100.4 102.5 203.0 100.10100.4 153.8 253.4 99.48100.5 153.8 253.9 99.74缬沙坦苄酯(valsartan benzyl ester)100.8 153.8 253.7 99.4199.72 0.69取样量/mg 样品中含量 /g 加入量/g 测得量/g 回收率/% 平均回收率 /% RSD/%91.83 100.1 51.25 151.5 100
18、.2991.85 100.1 51.25 151.9 101.0792.21 100.5 51.25 151.1 98.7391.93 100.2 102.5 202.1 99.4199.72 0.69Comment z2: 原料吗？批号不对应？核实Comment z3: 原料吗？批号不对应？核实Comment z4: 移至 2.192.38 100.7 102.5 202.4 99.2292.11 100.4 102.5 203.0 100.1092.10 100.4 153.8 253.4 99.4892.22 100.5 153.8 253.9 99.7492.48 100.8 153.
19、8 253.7 99.412.8 3.3 重复性试验取 6份同一批号的样供试品（缬沙坦片，批号：213041401），按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法，平行制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依法进样测定，记录色谱图，经标准曲线法计算供试品中缬沙坦苄酯的含量，缬沙坦苄酯的平均含量为 0.107%，其 RSD为 0.29%。， 说明方法重复性良好。2.6 3.4 精密度试验取混合对照品溶液，按 2.1项下色谱条件依法连续进样 6次，计算混合对照品溶液中缬沙坦苄酯色谱峰面积，结果其 RSD在为 0.11%以下，表明仪器进样精密度良好。2.7 3.5 稳定性试验取样品（缬沙坦片，批号：21
20、3041401），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别在第 0、2、4、8、12、24 h进样测定，测得缬沙坦苄酯峰面积的 RSD为：0.16%。，表明供试品溶液在 24 h内稳定。2.3 .6 专属性试验考察分别取混合对照品溶液、供试品溶液和空白辅料溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。结果主成分峰与各杂质峰之间分离度良好，基线平稳。分别取缬沙坦原料药约 25 mg，置 25 mL量瓶中，进行如下破坏试验：，（1）酸破坏：称取缬沙坦原料药约 25 mg，置 25 mL 量瓶中，加 0.1 mol/L-1 HCl 溶液 2 mL 溶解，置水浴中放置 2 h小时，放冷，加 0.1 mol/L-
21、1 NaOH 溶液 2mL 中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。；（2）碱破坏：称取缬沙坦原料药约 25 mg，置 25 mL 量瓶中， 加 0.1 mol/L-1 NaOH 溶液 2mL 溶解，置水浴中放置 2 h 小时，放冷，加 0.1 mol/L-1 HCl 溶液 2 mL 中和，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。；（3）光照破坏：称取缬沙坦原料药约 25 mg，置 25 mL 量瓶中，加流动相适量，置 4 500 lx 光照下放置 5 d；天，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。（4）高温破坏：称取缬沙坦原料药约 25 mg，置 25 mL 量瓶中，加流动相适量，置水浴中放置 5 h 小时
22、，放冷；，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。（5）氧化破坏：称取缬沙坦原料药约 25 mg，置 25 mL 量瓶中，加 30%过双氧化氢溶液水 2 mL，置水浴中放置 30 min，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。经上述精密量取经酸、碱、光照、高温、氧化破坏后的样品溶液，分别加流动相稀释至刻度，摇匀，依法进样测定。结果供试样品溶液除在光照破坏条件下没有产生新的杂质峰外，经高温、酸、碱和氧化破坏后均产生了杂质峰，见图 3。且杂质峰与缬沙坦、缬沙坦苄酯的分离度符合要求。经仪器光谱学纯度计算，缬沙坦峰和缬沙坦苄酯峰的光谱学纯度均大于仪器设定的阈值，表明杂质峰对缬沙坦与缬沙坦苄酯的测定没有干扰。B
23、AComment z5: 是原料还是制剂？A. 空白溶剂；B. 混合对照品溶液；C. 原料供试品溶液；1.缬沙坦；2.缬沙坦苄酯图 2 系统适用性试验空白溶液、混合对照品溶液及样品溶液色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of blank solution(A)，mixed reference substances(B) and sample(C)1.缬沙坦（valsartan） 2.缬沙坦苄酯（valsartan benzyl ester） CCA BDComment z6: 请将已知成分峰标出A.光照破坏； B.高温破坏； C.酸破坏； D.碱破坏；E.氧化破坏；1.缬沙
24、坦；2.缬沙坦苄酯图 3 专属性考察试验 HPLC色谱图Fig 3 the chromatograms of exclusion inspectionA.光照破坏(destroyed by intense light) B.高温破坏(destroyed by excessive heating) C.酸破坏(destroyed by acid) D.碱破坏(destroyed by alkali) E.氧化破坏(destroyed by oxidation)2.4 3.7 定量限与检测限将混合对照品溶液用流动相逐步级稀释，按“2.1”项下色谱条件依法测定，以 S/N =10求得缬沙坦与缬沙坦苄酯的定量限(LOQ)分别为 1.6ng和 3.1ng；，以 S/N= 3求得缬沙坦与缬沙坦苄酯的检测限(LOD) 分别为 0.55ng和 1.03ng。结果见表 1。2.10 4.1 相对校正因子的计算根据相关参考文献 6-8中相对校正因子的计算方法 6-8，本研究确E
